Development of micro-porous titanium scaffold for equipping antibacterial functions and promoting neointimal growths

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K12666
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 関根 一光 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 准教授 (50447182)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 浜田 賢一 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 教授 (00301317)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: スキャフォールド / 人工臓器 / 生体適合性

Outline of Annual Research Achievements

補助型人工心臓（VAD）の重症心疾患治療への臨床的効果は非常に高くなっているものの，感染を主因とした術後合併症例は依然少なくない。研究代表者らはこれまで進めてきた“構造学的”かつ“化学的”に血管内膜の術後早期での創生による生体親和性に付加価値として抗菌性を付与することを目的としている。人工材料，特に生体内で力学的にまた長期的に信頼性のあるチタン材料が依然使用される中で，内膜化を時間的に促進しつつ，抗菌性により術後合併症リスクを低減できる生体癒合性表面処理が確立されれば，医療貢献度は高いと考えている。
これまでの研究成果では，癒合性促進のためにI型コラーゲンによるウレタン様表面修飾法を確立したが，その代替として既に他方で抗菌性効果の報告のあるキチン－キトサンを採択し，これまでのI型コラーゲンと同様のウレタン様表面修飾における各修飾課程を達成出来るかどうかの評価を初年度の目標として進めてきた。I型コラーゲンと比する対象としてアミノ基を同価数となるように塗布が可能な溶液調整をおこなう必要があり，まずはその溶融性と固定化，またアミノ基を基にした定量を比色法によって評価した。この評価についてはいまだ継続中であるが，I型コラーゲンと同様な塗布溶液とするに至っていない。また，キチン－キトサンとは別の抗菌性の期待できる製剤，もしくは抗菌性付与方法についても検討・調査中であるが，絞り込むなどには至っていない。
これまでの評価において，in vitroの細胞接着性評価については線維芽細胞，および骨芽細胞を使用してきたが，組織化，特に血液接触表面としての効果を期待する側面から，ヒト血管内皮細胞による接着性および血管新生に至る課程の評価方法として，対称材料群として対称材料表層に施したマトリゲル基底膜マトリクスを採用し，そこへの血管新生度を基準とした組織様での評価方法の検討を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでの研究成果では，癒合性促進のためにI型コラーゲンによるウレタン様表面修飾法を確立した。その成果を基に，同等の細胞接着性，もしくはウレタン様修飾量となり，かつ抗菌性効果を備えることが，本課題の1年目および2年目での目的と位置づけている。
そこで，その代替として既に他方で抗菌性効果の報告のあるキチン－キトサンを採択し，これまでのI型コラーゲンと同様に，まずは水酸化チタン表面の作成をおこない，塩酸を溶媒としたキトサン塗布溶液の調整，そしてそれらのチタン表層へのウレタン様固定が必要になる。また，これまでの過酸化水素水による水酸化チタン表面処理は，錯体の影響による表面の必要以上な粗造化がおこるため，低侵食な水酸化処理法にまずは取り組んだ。その結果，これまでよりも低濃度の過酸化水素水液で必要充分な水酸化処理がおこなえることが確認でき，今後はこれを基準法とすることとした。
次に，キトサンによる修飾剤については，これまでのI型コラーゲンと同価数のアミノ基となるように塩酸溶液で調整をおこなって修飾処理をおこない，固定後に比色式タンパク定量法による表面処理面の剥離定量をおこなったところ，従来のI型コラーゲンと同等の修飾量を確認出来なかった。現在は，この方法での細胞接着性を基にした修飾効果の評価をおこなっており，その結果，また今後の菌類の付着性評価をもってI型コラーゲンとの比較検討とする予定である。
また並行して，キチン－キトサンとは別の抗菌性の期待できる製剤，もしくは抗菌性付与方法についても検討・調査中であるが，絞り込むなどには至っていない。

Strategy for Future Research Activity

現在継続中のキトサン液による，従来法と同等の修飾量，もしくは細胞接着性が達成されるかどうか，また菌類付着性試験もおこなうことで，総合的に細胞接着性の向上と抗菌性効果の共存の可能性を優先して進める予定である。同じくして，キチン－キトサンとは異なる抗菌性効果も達成可能なタンパク製剤の選択を進める。具体的な製剤については，未だ調査・検討中である。
これまでの評価において，in vitroの細胞接着性評価については線維芽細胞，および骨芽細胞を使用してきたが，組織化，特に血液接触表面としての効果を期待する側面から，ヒト血管内皮細胞による接着性および血管新生に至る課程の評価方法として，対称材料群として対称材料表層に施したマトリゲル基底膜マトリクスを採用し，そこへの血管新生度を基準とした組織様での評価方法の検討を進めている。これについて，上記の表面修飾性状を評価するためのもう一つの評価項目として採用し，in vivoを想定した評価方法としたい。そのため，まずは市販のマトリゲル製剤による混合法，サンドイッチ法などによるヒト臍帯細胞HUVECによる毛細血管様組織が可能な，バルクチタン材表面での作成を試み，可能であればそれを今後の対照群とする。
2年目の前半で細胞接着性と抗菌性の共存が確認できれば，後半には，まずは平滑なチタン材への表面修飾を施した材料を試験材として，成ヤギ筋層および大血管内への埋入試験をおこない，チタン表層との組織癒合性および血管内皮創生に達する期間などから，本課題の主観的達成目標について評価をおこなう予定である。

Causes of Carryover

（理由）2021年度は，本学施設改修に伴う研究室引越があり，一時実験自体が停止せざるを得なかった点，またコロナ禍の影響による学会参加費および動物実験の縮小を余儀なくされた点，さらに，独立基盤形成支援を採択頂いたことにより，当初購入予定であった物品費に予想以上の余剰が生じた点，以上の理由により，次年度使用額が生じた。
（使用計画）次年度は，生化学系実験評価がより進展する予定のため，それに伴う試料作製や高額試薬などにより多くの予算を使用する必要がある。また，中型動物による生体内埋入試験について学外研究機関との共同研究契約を締結済みであるため，それらに対する実験費用が必要となる。以上について，次年度分研究費と合わせて使用する予定である。