2022 Fiscal Year Research-status Report
Functional and Structural Relationship of V-ATPase Revealed by Single-Molecule Observation
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21K15060
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| Research Institution | Institute for Molecular Science |
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Principal Investigator |
大友 章裕 分子科学研究所, 生命・錯体分子科学研究領域, 助教 (30886560)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | １分子計測 / V-ATPase / エネルギー変換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
回転型ATPaseは生物に普遍的に存在する分子モータータンパク質であり、ATPの化学結合エネルギーと膜間の電気化学ポテンシャルとを回転運動を介して共役している最小のエネルギー変換装置として知られている。本研究ではその中でもナトリウムイオンを選択的に輸送する腸球菌由来V-ATPaseを用い、その回転機構および反応機構の解明を目指している。
2022年度は精製したV-ATPaseの１分子回転計測によりATP加水分解部位とイオン輸送部位との共役機構の一端を明らかにし、その成果を原著論文として発表した。実験の過程でイオン選択性に寄与していると考えられるアミノ酸残基を同定しそれらを変異させることで、腸球菌由来V-ATPaseをナトリウムイオン輸送型からプロトン輸送型に機能転換させることに成功した。この機能転換した変異体の生化学評価および１分子回転挙動を詳細に調べることで、回転型ATPaseにおけるイオン輸送機構の解明が期待できる。
並行して、腸球菌由来V-ATPaseの反応可逆性を検証するための生化学測定系およびスクリーニング系の立ち上げ中である。また人工小胞体を用いたナトリウムイオン輸送の定量実験にも取り組んでおり、これら各種生化学測定と１分子回転計測とを組み合わせることで、V-ATPaseの機能と連動した構造ダイナミクス解明を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに取り組んできた腸球菌由来V-ATPaseの１分子回転計測についての成果を原著論文として発表した。広範囲の回転型ATPaseの配列比較を実施し、イオン選択性に寄与する重要な残基を特定することで、腸球菌由来V-ATPaseをナトリウムイオン輸送型からプロトン輸送型へと切り替えた機能転換体を創生することに成功した。この機能転換体を評価するためにタンパク質を人工小胞体に再構成し、安定した活性測定法を確立することができた。この人工小胞体へのタンパク質の再構成は、腸球菌由来V-ATPaseの反応可逆性の検証にも使用可能であり、現在実験を進めている。反応可逆性の検証については、新たなスクリーニング系の構築を開始した。これら機能転換体やスクリーニング系の構築は新たな膜輸送体の研究にも発展し得ると期待している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに作製した様々な変異体の生化学手法による機能評価、１分子回転計測を進めていく。特にイオン選択性を変えた機能転換体では、これまで未解明であった回転型ATPaseにおけるイオン選択機構について迫ることができると考えられる。また、現在構築中である人工小胞体を用いたナトリウムイオン駆動のATP合成やナトリウムイオン輸送定量などを完成させ、１分子回転計測と組み合わせることで、回転運動と連動した回転型ATPaseの機能について明らかにしていく。
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