赤内型マラリア原虫における過酸化脂質代謝経路の解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K15429
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 福本 隼平 長崎大学, 熱帯医学研究所, 特別研究員 (30882401)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: マラリア / マラリア原虫 / 酸化脂質 / フェロトーシス

Outline of Annual Research Achievements

熱帯熱マラリア原虫は、侵入したヒト体内において赤血球に感染することで、様々な臨床症状（マラリア）を呈することが知られている。赤血球に感染したマラリア原虫は、肺から吸入された酸素やアミノ酸源とし自身が分解したヘモグロビン由来の活性酸素に晒されることになり、高度な酸化ストレスの下で増殖を行う必要がある。マラリア原虫が赤血球内で増殖を行うためには、自身にとって有害である酸化ストレス由来の過酸化脂質を除去する代謝経路が必要不可欠だと考えられるが、それらの知見は哺乳類細胞のものと比較して圧倒的に不足している。よって本研究では、赤内型マラリア原虫が有する過酸化脂質代謝経路の解析を行うことで、高度酸化ストレス下でのマラリア原虫の生存戦略を明らかにする。過酸化脂質酵素の原虫ホモログであるGPX4、GSTの詳細な機能解析は行われていないため、これらの遺伝子を改変した遺伝子改変原虫を使用して、原虫の酸化脂質に対するストレス応答を解析することを試みた。glmSリボザイムシステムを利用して、これらの遺伝子のコンディショナルノックダウン(cKD)原虫の作出に成功した。しかしながら、両cKD株とも遺伝子ノックダウン時における増殖速度は親株と比較して有意な違いは認められなかった。GPX4、GSTはいずれもノックアウトできないことが先行研究より明らかとなっているため、遺伝子発現が十分に阻害されれば増殖速度に違いがでるはずである。また、これらのcKD株は酸化ストレスに対しても親株との感受性の違いは認められなかった。このため、我々はglmSリボザイムシステムでは十分な遺伝子発現量の低下を当該遺伝子では誘導できていないと結論づけた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

酸化脂質代謝酵素の原虫ホモログであるGPX4、GSTはいずれもノックアウトできないことが先行研究より明らかとなっているため、DiCre システムを用いたコンディショナルノックアウト(cKO)株の作成を試みている。しかしながら、薬剤選択によるcKO株の取得が上手くいっておらず、cKO株の樹立に至っていないのが現状である。それにより、遺伝子改変原虫を用いた表現型解析が行えていない。

Strategy for Future Research Activity

現在までの進捗状況でも記載した通り、cKO株の樹立が上手くいっていないため、その次のステップである表現型解析に進めていないのが現状である。今後は、薬剤選択の条件検討を行い、再現性よくcKO株が取得する条件を探索する方針である。また、DiCre システムの代替として、CRISPR/Cas9 systemを用いたノックインシステムを用いて、cKO株を取得する方法も検討中である。我々の研究室ではCRISPR/Cas9 systemを用いた遺伝子改変原虫の取得に成功しており、ノックインシステムの導入は比較的容易であると考えている。

Causes of Carryover

酸化脂質代謝酵素の原虫ホモログであるGPX4、GSTはいずれもノックアウトできないことが先行研究より明らかとなっているため、DiCre システムを用いたコンディショナルノックアウト(cKO)株の作成を試みている。しかしながら、薬剤選択によるcKO株の取得が上手くいっておらず、cKO株の樹立に至っていないのが現状である。それにより、遺伝子改変原虫を用いた表現型解析が行えていない。そのため、表現型解析に使用するはずであった試薬の購入費や機器の使用料が当該年度で発生しておらず、次年度使用額が生じた。具体的には、原虫内酸化ストレスの観察に使用予定であった酸化ストレスインディケーターであるCM-H2DCFDAやBODIPY 581/591 C11、ノックアウトを誘導して当該遺伝子の原虫への影響を調査するために必要なラパマイシンなどの試薬を購入予定である。