ヒト癌オルガノイドオライブラリーを利用した治療抵抗性癌の発生・維持機構解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K18259
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 佐藤 卓 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 准教授 (40375259)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2027-03-31
• Keywords: ヒトがんオルガノイド / 化学療法耐性 / がん幹細胞 / 自己分泌

Outline of Annual Research Achievements

申請者は、独自に確立した舌がんオルガノイドライブラリーについて、実際に臨床治療に使われる、シスプラチンに対する感受性を検討し、これらのうち3症例の患者由来の舌がんオルガノイド株がシスプラチン耐性舌がん細胞を、相対的に多く含むことを見出している。また、これらのシスプラチン耐性舌がん細胞の網羅的遺伝子発現データから、複数（11種）の分泌因子の発現が、同がん細胞において特徴的に濃縮されていることを見出している。昨年度の研究において、当該分泌因子のうち分子Xに着目し、シスプラチンと分子X阻害剤をオルガノイド培養系に併用添加することで、シスプラチン耐性舌がん細胞の生存を有意に抑制することができた。一方、シスプラチン耐性舌がんオルガノイド株において、レンチウイルスベクター系を用いたノックダウンオルガノイド株を作製したが、分子Xのノックダウンによるシスプラチン感受性亢進はごくわずかでり、shRNAによるノックダウン効率が不十分であることによる可能性が想定された。そこで、本年度は、CRISPR/Cas9システムによる標的遺伝子ノックアウトオルガノイド系の確立を試みた。本年度は、各症例の化学療法剤耐性オルガノイドにおいてドキシサイクリン誘導性Cas9発現株を樹立した。
一方、昨年度までに樹立した食道扁平上皮がんオルガノイドについて化学療法剤感受性を評価し、これまでに複数の化学療法剤感受性の低いオルガノイド株を得た。また、これらについて、遺伝子変異解析、遺伝子発現解析を実施し、現在、これらに特徴的に発現されるな分泌因子を探索している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

舌癌オルガノイドでは、CRISPR/Cas9システムによる標的遺伝子ノックアウトオルガノイド系の確立に時間を要したため、計画が遅れている。一方、当初の計画通り、多症例の食道扁平上皮がん患者組織から樹立したがんオルガノイド株について遺伝子変異解析、遺伝子発現解析を進めることができた。

Strategy for Future Research Activity

次年度の計画では、CRISPR/Cas9システムによる標的遺伝子ノックアウトオルガノイド系の確立を進める。その上で、樹立したノックアウトオルガノイド株の化学療法剤応答性をin vitroで評価し、有意な化学療法剤感受性亢進を認めた場合には、in vivo PDXモデルでも評価する。一方、各症例由来の食道扁平上皮がんオルガノイドについて遺伝子発現解析を実施し、化学療法剤耐性オルガノイド株において、感受性オルガノイドに比べて有意に活性化している自己分泌経路（リガンド―受容体相互作用）を特定する。さらに、このような性質を付与するクロマチンアクセシビリティーの変化について、ATAC-seqにより検討し、有意に化学療法剤応答性と相関する転写制御機構を検討する。

Causes of Carryover

2023年度において、オルガノイド培養のための試薬の購入、および作出したオルガノイドの性能評価のための受託解析（変異解析、遺伝子発現解析、クロマチンアクセシビリティー解析）の実施が想定されるため、それらに上記次年度使用額を支出する。