2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of vanillin overproducer strains based on enhanced tolerance toward fermentation inhibition by the toxic product.
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21K19100
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| Research Institution | Research Institute of Innovative Technology for the Earth |
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Principal Investigator |
小暮 高久 公益財団法人地球環境産業技術研究機構, その他部局等, 主任研究員 (80422244)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | バニリン / コリネ型細菌 / 発酵生産 / 香料 / 毒性生産物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度は、コリネ型細菌における各バニリン高耐性化関連遺伝子の遺伝子破壊株の構築と、それらのバニリン耐性への影響評価を通じて、バニリン耐性に関与する3種の重要遺伝子を特定した。またバイオマス原料からのバニリン生産に関しては、コリネ型細菌に異種由来の芳香族カルボン酸還元酵素遺伝子を導入することにより、フェルラ酸からバニリン酸を介してバニリンを生産可能であることを実証した。当該年度は、特定した3種のバニリン高耐性化重要遺伝子の一つについて、その破壊による機能欠損が、バニリン耐性のみでなく、抗結核薬として使用されるタンパク質合成阻害薬であるカプレオマイシンに対する耐性をもたらすことを明らかにした。このことから、バニリン耐性化をもたらす分子機構の一つは、リボソームが関わる翻訳機能と関連していることが示唆された。また、コリネ型細菌におけるバニリン応答メカニズムの解明を目的としてRNAseq解析を前年度に引き続き実施し、バニリン応答遺伝子を特定するとともに、発現変動解析を通じて、菌が生育不可能な高濃度バニリンによってのみ強く発現誘導される遺伝子グループが存在することが明らかとなった。
一方、コリネ型細菌によるバニリン生産に関しては、プロトカテク酸高生産株を元株として、フェルラ酸からのバニリン生産に用いたものと同一の異種由来芳香族カルボン酸還元酵素遺伝子を導入することにより、グルコースからバニリン前駆体であるプロトカテクアルデヒドを主要生産物として生産可能な菌株を構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
バニリン高耐性化機構の解明に関しては、それに関与する重要遺伝子の一つの解析を通して、バニリン耐性がタンパク質の翻訳に関わる分子機構の修飾に基づいていることを示唆するデータを得ることができた。また、トランスクリプトーム解析を通じて、高濃度バニリン応答性の遺伝子群を特定できており、それらの中には発現制御因子や輸送体をコードするものなど興味深い遺伝子が含まれることが明らかとなっている。バニリン耐性への関与が明らかになっているその他の重要遺伝子についても、次年度以降、生化学的解析等に取り組むことで、バニリン耐性に関わる分子機構の一端が明らかになると予想される。
バニリンの生産については、異種由来芳香族カルボン酸還元酵素の導入により、フェルラ酸からバニリンを生産可能な菌株は構築できており、また、糖からはバニリン前駆体であるプロトカテクアルデヒドが主要生産物として生成することが確認された。今後、該前駆体のバニリンへの変換を触媒する異種由来O-メチル化酵素遺伝子を導入することにより、糖からのバニリン生産が実証可能と考えられ、バニリン高耐性化株でのバニリン生産に向けて研究が進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究推進の方向性として、以下の項目を実施する。
・バニリン高耐性化に関わる3種の重要遺伝子がコードする酵素や制御因子について、それらの生化学的解析を進め、バニリン耐性化の分子機構を明らかにする。
・糖からのバニリン生産に関しては、前駆体であるプロトカテクアルデヒドのバニリンへの変換を触媒する異種由来O-メチル化酵素遺伝子の共発現によるバニリン生産実証を目指す。また、フェルラ酸からのバニリン生産については、バニリン酸からバニリンへの変換効率の向上を目指す。
・トランスクリプトーム解析によって特定したバニリン応答遺伝子について、それらの遺伝子破壊株の解析等を通じてバニリン耐性への関与の可能性を検証する。
・バニリン高耐性化株をベースとしたバニリン生産株の構築と生産性検証を行う。
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| Causes of Carryover |
RNAシーケンス解析の外注費用が次年度支払いとなったこと、物品購入を次年度に先延ばししたこと、コロナの影響で学会はウェブ参加となり、出張費が計上されなかったこと等による。残額は最終年度中に計画的に使用する予定である。
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Research Products
(1 results)
