機能的スクリーニングによる種特異的精子形成誘導因子の同定

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K19194
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 久保田 浩司 北里大学, 獣医学部, 教授 (80263094)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2025-03-31
• Keywords: 精原幹細胞 / 精子形成 / 異種移植 / 機能発現クローニング / ウシ

Outline of Annual Research Achievements

分化誘導刺激に用いるウシ精原幹細胞を得るために精子形成前のウシ精巣から精原幹細胞の前駆細胞であるゴノサイト(前精原細胞)の分離方法を確立した。ゴノサイトの細胞表面形質を指標にフローサイトメトリーにてゴノサイトの含有率を解析した結果、未成熟ウシ精巣から調整した細胞浮遊液に含まれるゴノサイトは数％に満たなかったが、ゴノサイトの低接着性を利用した濃縮を行うことにより、ゴノサイトを70％以上含む細胞浮遊液を得ることができた。この分離・濃縮法はセルソーターや磁気ビーズなどの特別な機器や試薬を必要とせず容易に大量のゴノサイトを得ることが可能な方法であり、ゴノサイトから精原幹細胞への移行を促す培養系の検討を効率的に行うことができるようになった。
分化因子を誘導発現させるためのcDNAライブラリーはテトラサイクリン(Tet)誘導発現系を利用する計画であるが、本誘導系が哺乳動物精原幹細胞で機能するかは不明であった。cDNAライブラリーを構築するためのベクターの検討のため、Tet応答性転写因子発現ユニットとTet応答因子配列下流に緑色蛍光タンパク質(EGFP)レポーター遺伝子発現ユニットを組み合わせたトランスポゾンベクターを作成した。作成したトランスポゾンベクターをマウス精原幹細胞に電気穿孔法により遺伝子導入し、誘導物質であるTet誘導体ドキシサイクリン(Dox)によるEGFP発現誘導を行ったところ、Dox非存在下ではEGFPの発現が認められない一方、Dox添加後、速やかにEGFPの誘導発現を確認した。本結果によりTet誘導発現トランスポゾンベクター系が分化因子を誘導発現させるためのcDNAライブラリーの構築に適していることを確認した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ウシゴノサイトの細胞表面形質の同定と分離法を確立したこと、Tet誘導発現トランスポゾンベクター系が精原幹細胞において機能することが示され、cDNAライブラリーを構築するためのベクター系が確立されたことは重要な進展である。しかし、分化刺激したウシ精原幹細胞のcDNAライブラリーの作成に着手できなかったことから、やや遅れていると評価した。

Strategy for Future Research Activity

これまで申請者が確立してきた精原幹細胞培養系においてゴノサイトから精原幹細胞への移行は自発的に行われる。均一な未分化状態の精原幹細胞を得るために、ゴノサイトから精原幹細胞への移行を促進させる培養条件を検討する。さらにレチノイン酸刺激により精原幹細胞からの分化誘導を促進する培養条件を検討する。こうして得られた分化誘導刺激したウシ精原幹細胞を用いてTet誘導発現トランスポゾンベクターを基本構造としたDNAライブラリーを作成する計画である。

Causes of Carryover

cDNAライブラリーを作製するための細胞培養試薬及び遺伝子工学試薬を購入しなかったことが次年度使用額が生じた理由である。
準備が整い次第、速やかにcDNAライブラリーの作成に着手する予定である。