2021 Fiscal Year Research-status Report
Development of a screening procedure for muscle hypertrophy/atrophy related molecules by using myotube cells and comprehensive gene knockdown
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21K19737
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Research Institution | Nippon Sport Science University |
Principal Investigator |
中里 浩一 日本体育大学, 保健医療学部, 教授 (00307993)
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Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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Keywords | Nsmaf / 炎症 / 骨格筋分化 / Myomixer |
Outline of Annual Research Achievements |
neutral sphingomyelinase activation associated factor (Nsmaf)は中性スフィンゴミエリナーゼを活性化することでセラミド合成を調節する因子と報告されている。またNsmafはTNFαのシグナル伝達経路を調節する因子としても知られている。本研究においてNsmafをサイレンシングすることによりげっ歯類由来C2C12筋細胞の筋分化および筋タンパク質合成調節に関与するかを検討した。低分子干渉RNA(siRNA)を用いてNsmaf遺伝子発現を抑制(ノックダウン;KD)した(NsmafKD群)。スクランブル配列を有し非特異的配列を有するsiRNA処理をコントロールとした(Scr群)。実験はそれぞれ6試行実施した。遺伝子ノックダウンは筋芽細胞、筋管細胞の両方で行った。タンパク質発現はウエスタンブロッティング法、mRNA発現は定量的逆転写PCR法を用いてそれぞれ定量を行った。タンパク質合成定量にはSUnSET法を用いた。筋芽細胞においてNsmafKDにより分化前の細胞であっても分化が誘導されたような紡錘状の形態を示すことが観察された。分化マーカーであるmyogeninやミオシン重鎖などはNsmafKDにより有意に発現上昇され、NsmafKDが筋分化を促進していることが示された。筋管細胞においてNsmafKDによって筋管の直径が細くなる様子が観察された。筋管形態に強い影響を与えるタンパク質合成は増加していたものの、筋細胞同士の融合に関わるとされるMyomixerがNsmafKDによって有意に減少していることが観察された。以上の結果からNsmafは筋分化や筋細胞融合に影響を与える新規筋分化制御因子であることが明確に示された。今後Nsmafが炎症反応における骨格筋萎縮においてどのような役割を果たすかを解明することが重要である。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
探索的ノックダウンにより発見されたNsmafが筋分化の鍵分子である証拠が得られたため
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Strategy for Future Research Activity |
2022年度は探索的RNA干渉による新規筋形態制御遺伝子抽出の試みとしてFoxO遺伝子群のノックダウンを行う。多彩な機能を有するFoxO遺伝子群は探索的RNA干渉のターゲットとして最適である。FoxO遺伝子群から転写翻訳されるタンパク質は共通にDNA結合ドメイン、核移行シグナルドメイン、トランスアクティベーションドメインを有しており、DAF-16a、dFoxO、FoxO1、FoxO3、FoxO4、FoxO6の6種類からなる。2022年度はこれらを探索的にノックダウンすることにより筋形態制御遺伝子の抽出を試みる。探索的RNA干渉を行う対象はC2C12細胞とする。セラミド合成酵素の探索的RNA干渉時と同様C2C12細胞が筋菅を形成した後FoxO遺伝子群のsiRNA処理を行うことでノックダウンを試みる。ノックダウン後形態観察することでFoxO遺伝子群の中で筋管形成に強い影響を与える遺伝子を抽出する。特異的な遺伝子が抽出された場合、筋タンパク質合成および分解とそのシグナル分子、筋管融合に関わる因子、筋分化応答などを評価し、筋管形成への寄与の分子メカニズムを明らかにする。探索的ノックダウンによって抽出された分子群についてはウイルスベクターを用いて目的分子を強制発現させることによりその生理的役割を明らかにする。 本研究の第二の目的である探索的RNA干渉による骨格筋携帯制御因子抽出法の確立に向けて、これまでの成果の蓄積によって筋形態制御に強い影響を与え、そのキャラクターが確立されている分子群のRNA干渉による微分干渉観察画像、筋分化マーカーによる染色像、筋タンパク質合成亢進時に膿染するピューロマイシン染色の教師画像をPCに機械学習させる。その後微分干渉像のみから筋分化促進あるいは筋タンパク質合成亢進を判断可能な機械学習を構築することで、ハイスループットな探索的RNA干渉系の確立を目指す。
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Causes of Carryover |
昨年度は本研究費支払いが発生するまでに実験自体が進行しておりデータ解析のみで研究は推進できたために予定していた実験(ウイルスベクター使用)は次年度に実施することとした。
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Research Products
(3 results)