新規糖鎖特異的単鎖抗体の大腸菌発現系による大量発現と糖鎖結合性解析

2010 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22570125
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 山口 陽子 東海大学, 工学部, 教授 (10328106)
• Keywords: 大腸菌発現系 / 封入体 / 単鎖抗体 / 糖鎖結合性 / 糖鎖親和性

Research Abstract

本研究では、過去5年間に取得した糖鎖特異的ヒト型単鎖抗体(scFv)の精製と詳細な構造及び結合性解析を目的としている。ヒト型抗体はがんを含む様々な病の分子標的治療に有用である。糖鎖は、がんの転移や浸潤、細菌やウイルスの感染症などに関わっていることから、その抗体取得は治療薬開発用に嘱望されるところだが、糖鎖は自己抗原である為、高い親和性を有する糖鎖に対するIgGは生体免疫では得がたかった。申請者は、ファージディスプレイ法による生体外でのヒト型抗体の作製を提案し、10^<-9>オーダーの高い結合性を有する抗Man3抗体及び抗Le^x抗体の作製に成功したが、その過程で様々な問題点が明らかになった。本研究は、困難であったscFvの大量調製に向けてリフォールディング法を改良し、T-抗原scFvsの大腸菌での大量発現・精製に成功した予備実験を元に、以下の研究を実施する。
(目的1) 抗T-抗原scFvsの大量調製と糖鎖結合性解析。
(目的2) 抗Man3、抗Le^x scFvsの大量調製と糖鎖結合性解析。
本研究は抗体医薬創成を長期目標とした基礎研究と位置付けられる。糖鎖親和性に加え、さらに、糖鎖特異性をSPR解析・糖鎖マイクロアレイなどで詳細に検討し、抗Man3 5A3と抗Le^x 1F12 scFv-Fcは細胞外に分泌されるが、抗Man3 1A4&1G4及び抗Le^x 3F1 scFv-FcはERに滞留する原因解明に迫る。最も研究する意義のあるクローンについて、研究連携者の山口芳樹博士のグループに精製単鎖抗体を提供しNMR解析を進める。
(目的1) 抗T-抗原scFvsの大量調製と糖鎖結合性解析の方法論を確立した。
(目的2) 目的1で達成された大腸菌での大量発現・精製法を応用し、抗Man3 5A3,1A4 & 1G4 scFvs及び抗Le^x 3F1 & 1F12 scFvsの発現・精製実験を進めた。

Research Products

• [Journal Article] がん診断薬・抗体療法向け創薬を目指した糖鎖特異的ヒト型抗体の開発 (2011)
  • Author(s): 山口(藤田)陽子、高崎(松本)綾乃、酒井恵子、湯浅徳行
  • Journal Title: Journal of the Society of Japanese Women Scientists Volume: 11 Pages: 19-28
• [Journal Article] Preparation of asialo-agalacto-glycophorin A for screening of and-Tn antibodies. (2010)
  • Author(s): Koizumi, T., Matsumoto-Takasaki, A., Nakada, H., Nakata, M., Fujita-Yamaguchi, Y.
  • Journal Title: Bioscience Trends Volume: 4 Pages: 308-311
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Production of anti-carbohydrate antibodies by phage-display technologies : Potential impairment of cell growth as a result of endogenous expression. (2010)
  • Author(s): Yuasa, N., Zhang, W., Goto, T., Sakaue, H., Matsumoto- Takasaki, A., Kimura, M., Ohshima, H., Tsuchida, Y., Koizumi, T., Sakai, K., Kojima, T., Yamamoto, K., Nakata, M., Fujita-Yamaguchi, Y.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. Volume: 285 Pages: 30587-30597
  • Peer Reviewed
• [Presentation] In vitro production of anti-carbohydrate antibodies : Purification of anti-trimannose single chain antibodies (scFvs) from inclusion bodies (2011)
  • Author(s): Daiichi Katagiri, Tubasa Koyama, Ayano Matsumoto-Takasaki, Nobuyuki Yuasa, Munehiro Nakata, Yoko Fujita-Yamaguchi
  • Organizer: 241^<st> American Chemical Society National Meetingand Exposition
  • Place of Presentation: Anaheim, CA, USA
  • Year and Date: 20110326-20110331
• [Presentation] Purification and characterization of anti-LNFPIII single chain antibody (scFv) conjugated with Fc from CHO cells transfected with 3F1 scFv-Fcgene (2011)
  • Author(s): Yasunobu Tsuchida, Kaname Funayama, Daisuke Kubo, Noriyuki Yuasa, Yoko Fujita-Yamaguchi
  • Organizer: 241^<st> American Chemical Society National Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: Anaheim, CA, USA
  • Year and Date: 20110326-20110331
• [Presentation] Expression and purification of single chain antibodies (scFvs) isolated from aphage-displayed library with LNFPIII (Le^x) probe (2011)
  • Author(s): Hiroyuki Kato, Haruhiko Ogawa, Masato Takano, Daiichi Katagiri, Kotaro Kawamoto, Noriyuki Yuasa, Ayano Matsumoto-Takasaki, Yoko Fujita-Yamaguchi
  • Organizer: 241^<st> American Chemical Society National Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: Anaheim, CA, USA
  • Year and Date: 20110326-20110331
• [Presentation] Refolding and characterization of three anti-mannotriose single chain antibodies (2010)
  • Author(s): Katagiri, D., Matsumoto-Takasaki, A., Yuasa, N., Koyama, T., Ogawa, H. Sakai, K., Takayanagi, A., Nakata, M., Fujita-Yamaguchi, Y.
  • Organizer: BMB2010(日本生化学会・分子生物学会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド(兵庫県)
  • Year and Date: 20101207-20101209
• [Presentation] Purification and characterization of anti-LNFPIII antibody expressed in CHO cells (2010)
  • Author(s): Tsutida, Y., Yuasa, N., Goto, T., Kubo, T., Zhang, W., Fujita-Yamaguchi, Y.
  • Organizer: BMB2010(日本生化学会・分子生物学会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド(兵庫県)
  • Year and Date: 20101207-20101209
• [Presentation] Establishment of overproduction procedure for anti-Tn antigen MLS128 single-chain Fv fragment toward the structural studies. (2010)
  • Author(s): Subedi, G. P., Satoh, T., Hanashima, S., Ikeda, A, Nakada, H., Sato, R., Mizuno, M., Yuasa, N., Fujita-Yamaguchi, Y., Yamaguchi, Y.
  • Organizer: BMB2010(日本生化学会・分子生物学会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド(兵庫県)
  • Year and Date: 20101207-20101209
• [Presentation] In vitro production of anti-carbohydrate antibodies : Purification of anti-T-antigen (beta Gall-3GalNAc-Thr/Ser) single chain antibodies (scFvs) from inclusion bodies. (2010)
  • Author(s): Matsumoto-Takasaki, A., Yamaguchi, S., Koizumi, T., Yuasa, N., Fujita-Yamaguchi, Y.
  • Organizer: 240^<th> American Chemical Society National Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: Boston, MA, USA
  • Year and Date: 20100822-20100825