2012 Fiscal Year Annual Research Report
活性型ＧＰＣＲとその特異的抗体による共結晶化から構造解析へ向けて
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22590270
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
浅田 秀基 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20399041)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
白石 充典 九州大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (00380527)
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| Project Period (FY) |
2010-04-01 – 2013-03-31
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| Keywords | 構造生物 / GPCR / 抗体 / 結晶化 / X線結晶構造解析 |
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| Research Abstract |
本研究は昆虫（Sf9）細胞発現系を用いて、①ヒトの膜タンパク質であるGPCR（Gタンパク質共役受容体）を当該細胞に大量に発現させる。②大量発現させた受容体を精製し、タンパク質としての性質を検討する。③精製したGPCRを用いて特異的な構造認識抗体を作製する。④GPCRと抗体の共結晶を作製する。⑤受容体の構造をＸ線回折により解くことを目的とした。GPCRの構造解析は非常に難しく、本研究課題の遂行によりGPCRの構造決定の進展に寄与するものと考えられる。本研究期間に、アンジオテンシン2型受容体（AT2）の大量生産、精製、特異的抗体、および共結晶化に成功した。AT2の大量生産において、5Lの昆虫細胞の培養を行い、FACS解析から約70%のAT2が、またリガンド結合試験から平均80.36pmol/mlのAT2が発現しているのを確認した。大量生産した昆虫細胞を用いた精製系の検討により、5L培養分から約2mgのAT2が精製できるまでに至った。精製したAT2はリポソームに再構成し、特異的構造認識抗体取得の為にマウスへ免疫した。免疫されたマウスの脾臓から免疫細胞を採取し、ミエローマ細胞と融合することでハイブリドーマを作製し、その中からAT2特異的構造認識抗体のスクリーニングを行なった。1次スクリーニングから96サンプルの候補を、2次スクリーニングから15サンプルが得られた。これらの抗体についてAT2と共結晶化した結果、3つの抗体において微結晶が得られた。このうちの１つについてさらに結晶化の条件を検討した結果、結晶の成長が認められた。この結晶をSPring-8にてＸ線による回折像の取得を試みたが、分解能が低く構造決定までは至らなかった。これらの結果から、本研究課題の目的は達成されたものと考えられる。今後はGPCR特異的構造認識抗体との共結晶化の条件を更に検討し、AT2の構造を決定したい。
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| Current Status of Research Progress |
Reason
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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[Journal Article] Platform for the rapid construction and evaluation of GPCRs for crystallography in Saccharomyces cerevisiae.2012
Author(s)
Shiroishi M, Tsujimoto H, Makyio H, Asada H, Yurugi-Kobayashi T, Shimamura T, Murata T, Nomura N, Haga T, Iwata S, Kobayashi T.
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Journal Title
Microb Cell Fact.
Volume: 11:78
Pages: -
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist.2012
Author(s)
Haga K, Kruse AC, Asada H, Yurugi-Kobayashi T, Shiroishi M, Zhang C, Weis WI, Okada T, Kobilka BK, Haga T, Kobayashi T.
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Journal Title
Nature
Volume: 482
Pages: 547-51
DOI
Peer Reviewed
