2010 Fiscal Year Annual Research Report
ATPプローブを用いた膵島、骨格筋、心筋細胞内ATP濃度リアルタイムモニタリング
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22590977
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
長嶋 一昭 京都大学, 医学研究科, 講師 (40324628)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
今村 博臣 大阪大学, 産業科学研究所, 特別科学研究員 (20422545)
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| Keywords | ATP / K_<ATP>チャネル / 糖代謝 |
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| Research Abstract |
本年度の研究は平成22年度交付申請研究実施計画に沿って進められ、研究成果は以下の通りである。
(1) 既に構築済の2種類の細胞内ATP濃度測定用プローブ(ATeam)を基に、細胞内ATP濃度が高い(数mM程度)膵β細胞での使用を可能とするため、よりKd値が高いATPプローブを作成。
(2) ATPプローブの細胞内導入法(リポフェクション法)、生細胞を用いた細胞内ATP濃度測定法(励起波長427nm、蛍光波長542nm(YFP)および483nm(CFP)で測定、YFP/CFP ratioを計算、既知濃度ATP-YFP/CFP ratio曲線により細胞内ATP濃度を算出)を確立。
(3) 同測定システムに、従来からシステム構築済の細胞内Ca^<2+>濃度測定(Fura2-AMを用いた励起波長340nm/380nm、蛍光波長510nmの二波長励起一波長測光)システムを併合し、単一細胞での複数の細胞内シグナル同時モニタリングシステムを構築した。
(4) 同プローブ蛋白を恒常的に発現するMIN6細胞株(stable cell line)作製を開始し、現在、限界希釈法、ペニシリンキャップ法にて細胞クローニング中。今後、同細胞株を用いてtransientな系よりも生理的条件に近い状態で、細胞内ATP濃度変化をin vitro解析予定。
(5) ATeam遺伝子導入(Tg)マウス作成開始し、ファウンダーマウスが誕生、現在25匹を哺育中。
従来までの細胞内ATP濃度測定は、定点測定であり、生細胞のまま経時的測定ができず、繊細な動態を示す細胞内代謝変化を理解する上で全く不十分であったが、本研究の進展により、生細胞のまま細胞内ATP濃度が実測可能となり、細胞内ATP濃度変化が細胞機能に重要な役割を担っている膵β細胞(インスリン分泌調節に関与)、骨格筋細胞(インスリン抵抗性に関与)、心筋細胞(虚血時心筋保護に関与)の生理的条件下における細胞内ATP濃度実測値に基づいた組織特異的K_<ATP>チャネルの生理的役割の実際を検証することが可能となる。本研究は当該研究領域進展のためのbreakthroughとなり得る可能性を有し非常に意義深いものと考えられる。
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