2010 Fiscal Year Annual Research Report
インフルエンザウイルス子孫vRNP複合体の可視化による細胞質内極性輸送機構の解析
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22790438
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
百瀬 文隆 北里大学, 大学院・感染制御科学府, 講師 (90332204)
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| Keywords | インフルエンザウイルス / RNP複合体 / ライブセルイメージング / モノクローナル抗体 / タンパク質導入 / 微小管輸送 / 極性輸送 / リサイクリングエンドソーム |
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| Research Abstract |
本研究の目的は、インフルエンザウイルス分節化RNAゲノム-タンパク質複合体(vRNP)の極性輸送を分子レベルで解明することである。報告者等が作製した「RNP複合体と優先的に結合する抗NPモノクローナル抗体(mAb61A5)」が細胞質に存在する子孫vRNPの検出に利用できる事を、マイナス鎖ウイルスRNAゲノムとの共局在を示すことにより証明した。タンパク質トランスフェクション法により蛍光標識mAb61A5を感染細胞へ導入しライブセルイメージングを行なった。その結果、vRNP陽性輸送小胞は微小管に沿って約1.5μm/sの速度で移動している事が判明した。各種オルガネラマーカーを用いて子孫vRNPがリサイクリングエンドソーム(RE)に局在することを明らかにし、この局在が宿主Rab11タンパク質に依存する事を見いだした。Rab11変異体を作製しvRNPとの相互作用を試験管内および細胞内で調べた結果、vRNP複合体は含有するウイルスRNAポリメラーゼを介してGTP結合型/活性型のRab11分子と相互作用することが判明した。Rab11エフェクタータンパク質であるRab11-FIPタンパク質5種類の欠損変異体を作製し、各変異体を強制発現したMDCK細胞におけるvRNPのRE局在と極性輸送を観察した。その結果、Rab11-FIPのRab結合ドメインのみを過剰発現した細胞では、5種類いずれの場合でもvRNPのRE局在が阻害された。また、Rab11-FIP3/4のRab結合ドメイン欠損変異体を強制発現させると、vRNPのRE局在は阻害しないがvRNP陽性小胞の細胞質内局在に異常がみられ、アピカル面へのvRNP極性輸送が阻害された。これらの結果より、Rab11との相互作用に加え、Rab11-FIP3/4に依存する宿主の小胞輸送機構がvRNPの極性輸送に必要であることが判明した。
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