2022 Fiscal Year Research-status Report
レクチン（糖認識ドメイン）表層発現酵母創製技術の確立とバイオ分析技術への新展開
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22K05162
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| Research Institution | Fukui National College of Technology |
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Principal Investigator |
高山 勝己 福井工業高等専門学校, 物質工学科, 教授 (70226934)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松野 敏英 福井工業高等専門学校, 物質工学科, 准教授 (40557443)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | 酵母細胞表層工学 / マンノース糖鎖認識レクチン / GPIアンカー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度の計画は，細胞表層工学技術を用いて酵母Saccharomyces cerevisiae MT8-1株の細胞表層にマンノース結合レクチン（MBL）の糖認識ドメイン（CRD）を発現させるためのプラスミドを構築（pMW MBL/CRD）し，最適な表層発現条件を確立した後、発現の確認を抗体染色による直接蛍光顕微鏡観察により行う事を目的とした．
初年度１年間に実施された研究の具体的流れを以下に示す。1）ヒトMBL/CRD（エクソン4領域）遺伝子配列情報をDDBJデータベースから入手し、業者委託によりMBL/CRD遺伝子インサートを合成した。2）酵母表層発現用ベクター（GPIアンカーを介して、酵母細胞表層に任意のタンパク質をN-末を介して発現するためのカセットシャトルベクター：pMWFD）に、MBL/CRD遺伝子配列を持つDNAインサートを、TAKARA社のインフュージョン法を用いて、組込みpMW MBL/CRDプラスミドを構築した。3）大腸菌（DH５α株）にpMW MBL/CRDを形質転換した後、表層発現ベクターの必要量を確保し、続いて酵母MT8-1株に形質転換した。4）pMW MBL/CRD遺伝子配列のシークエンスを業者委託により行い、pMW MBL/CRDが意図した位置に挿入され、配列が設計通りであるか（変異が起こっていないこと）確認を行った。5）酵母用選択培地を用いて（25℃、pH7）で、定常状態まで培養し、酵母細胞を遠心分離により回収した。6）MBL/CRDタンパクが酵母表層に発現されているか確認するために、MBL/CRD配列末端に付加したFLAGタグに、抗FLAG抗体染色を行ってから、蛍光顕微鏡観察を行った。しかしながら、一部の酵母に対して、表層発現が確認されたが殆どの酵母は発現がみられなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究の開始初年度として、マンノース糖鎖認識レクチンドメインを酵母細胞表層に発現するためのベクターを計画通り完成することができた。ただし、任意の培養条件下で、表層発現を誘導し、FLAG抗体染色により表層発現の確認を行ったが十分な発現が確認できなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
酵母表層にマンノース認識レクチンドメインが発現する培養条件を詳細に検討することが第一である。具体的には以下のようになる。培地組成や誘導条件（温度、pH、培養終了のタイミングなど）の最適化を行い、MBL/CRD表層発現の最適化を行う。MBL/CRDが酵母表層へ発現されたことを確認するために、MBL/CRD末端に付加させたFLAGタグに対するFLAG抗体染色を行い、蛍光顕微鏡観察を行う。培養条件の変更で発現が上手くいかない場合は、ベクター中のプロモーター（4種類）とアンカー（2種類）の組み合わせを変更しプラスミドの再構築となる（4×3＝12パターンが可能）。
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| Causes of Carryover |
初年度に購入予定であった蛍光プレートリーダー（高額備品）を研究進捗状況を鑑みて次年度以降に先送りとしたことによる。
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| Remarks |
研究課題内容の簡単な紹介（今後の成果について随時掲載予定）
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