オルガネラ間相互作用による出芽酵母液胞膜イオンチャネルの活性化機構の研究

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K05425
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 浜本 晋 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任助教 (10533812)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: イオンチャネル / 出芽酵母 / 高浸透圧応答 / オルガネラ膜 / 電気生理学

Outline of Annual Research Achievements

①出芽酵母TRPチャネルTRPY1は、細胞外の浸透圧変化に応答して液胞から細胞質にCa2+を放出する液胞膜局在性陽イオンチャネルであるが、その浸透圧変化を感知する分子機構は不明である。本研究では、TRPY1の高浸透圧応答に関わる制御因子の同定を目的に、出芽酵母の一遺伝子破壊株コレクション5100株を用いたイクオリンアッセイによるCa2+の発光検出を行った。高浸透圧ストレス応答に変化が観察された43株において破壊されている遺伝子を野生株からクローニングして各遺伝子破壊株に再導入したところ、7つの遺伝子発現株においてTRPY1の高浸透圧応答活性が相補された。このことから、この7つをTRPY1の高浸透圧応答活性の制御候補因子とした。細胞内Ca2+の検出、タンパク質相互作用、電気生理学的解析手法の一つであるパッチクランプ法を用いてTRPY1のイオンチャネル活性を評価し、これらの候補制御因子によるTRPY1の活性制御機構の解明を目指す。
②多くのオルガネラはサイズが小さいことからパッチクランプ法の適用が難しい。そのため、オルガネラ膜局在性イオンチャネルの研究は遅れている。出芽酵母の液胞はパッチクランプ法の適用が可能なサイズに巨大化することが可能であることから、これまでに幾つかのイオンチャネル活性の異種発現と活性測定に成功している。本研究では、オルガネラ膜局在性イオンチャネルを出芽酵母液胞膜に局在化させるシグナル配列の開発を行い、出芽酵母液胞膜を用いた機能解析系の構築を目指している。前年度までに見出したシグナル配列（X18タグ）の付加により、チラコイド膜局在性イオンチャネルを出芽酵母液胞膜に発現させることに成功しているが、未だ多くのイオン輸送体においては液胞膜への局在化が達成されていない。本年度以降の研究においてシグナル配列の改良を行う。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

①遺伝子破壊によりTRPY1の高浸透圧応答が欠失し、遺伝子破壊株への再導入によりTRPY1の高浸透圧応答が回復した7つの候補因子は、データベース上の機能からはTRPY1との機能的な関連性は見出されていない。七つの候補因子のうちの一つは、哺乳類細胞において小胞体（ER）のCa2+恒常性に寄与していることが報告されているが、その分子機能は不明である。TRPY1と候補因子の相互作用解析の検討を目的に、TRPY1のN末端とC末端の細胞質領域と7つの候補因子をpCold発現系を用いて発現精製を行なった。これらのタンパク質を用いてプルダウンアッセイを行ったが、いずれの候補因子もTRPY1の細胞質領域とのタンパク質間相互作用は確認されなかった。
②本研究で見出したX18タグを由来の異なる8つのオルガネラ膜タンパク質に付与したところ、シロイヌナズナのチラコイド膜イオン輸送体V（仮名）とシロイヌナズナの液胞膜の陰イオン輸送体AtCLCa、ラン藻Synechocystis PCC 6803のチラコイド膜イオン輸送体Stc1(仮名) の出芽酵母液胞膜への局在性効率の上昇が観察された。しかし、残りの5つのオルガネラ膜輸送体は、出芽酵母の液胞膜ではなくER膜への局在が確認された。より多くのオルガネラ膜タンパク質の出芽酵母液胞膜への発現を目指し、一部の液胞膜局在性タンパク質で確認されているN末端細胞質領域のdi-leucineモチーフ（XLL、Xは多くの場合Pro）とC18タグの併用を試みたが、液胞膜への局在化は見られなかった。

Strategy for Future Research Activity

①7つの候補遺伝子について、過剰発現株もしくは遺伝子破壊株を用いてパッチクランプ法による電気生理学的解析を行い、TRPY1チャネルの活性化もしくはコンダクタンスに変化が見られるか検討する。さらに、TRPY1を発現する液胞に7つの候補因子の精製タンパク質を投与してパッチクランプ測定を行い、TRPY1の活性に変化が生じるか検討する。幾つかの候補因子は、液胞膜とミトコンドリア外膜とのオルガネラ結合（vClamp）に関わる液胞膜タンパク質VPS39との相互作用が報告されている。VPS39以外にも複数の膜タンパク質がvCLAMPの構築に関わっていることが報告されているため、これらの遺伝子欠損株を用いてイクオリンアッセイを行い、vClampがTRPY1の浸透圧応答に寄与しているか検討する。さらに、ミトコンドリアを出芽酵母から単離し、パッチクランプ測定中の液胞に投与するin vivo実験を行い、TRPY1の活性を評価する。
②出芽酵母の液胞膜に発現しなかったオルガネラ膜局在性イオンチャネルはいずれも出芽酵母のERへの発現が確認されているため、これらのタンパク質はいずれもER膜への挿入は行われていたと考えられる。この結果から、ER膜からゴルジ体への小胞輸送において、目的の膜タンパク質が積荷タンパク質として認識されていないことが示唆された。この結果を踏まえ、これまでに検討を行ったdi-leucineモチーフ以外のER exitシグナルをオルガネラ膜局在性イオンチャネルに付与し、液胞膜への発現効率が上昇するか検討する。

Causes of Carryover

①候補タンパク質の有無によりTRPY1のチャネル活性に変化が生じるかイクオリンアッセイにより検討する。さらに、パッチクランプ法を用いてTRPY1のチャネル活性に変化が見られるかチャネルコンダクタンスの測定、膜電位依存性等を検討する。ER exitシグナルの付与により、オルガネラ膜局在性イオンチャネルがERから出芽酵母液胞膜に移行するか次年度に検討する。
②di-leucineモチーフ以外のER exitシグナルを付与したタグを用いて出芽酵母に異種発現したオルガネラ膜タンパク質の細胞内局在の検討を行う。
以上を行うため、2022年度に購入を予定していた遺伝子工学試薬、生化学試薬、培地、消耗品を次年度に購入することとした。さらに、遺伝子破壊株を用いた電気生理学的解析を行うために、電気生理学的実験用の消耗品であるガラス器具、プラスチック器具、電子部品を購入する。電気生理学的実験に用いる巨大化酵母の調製などに必要となる培地試薬、化学薬品、酵素試薬などの消耗品を購入する。遺伝子破壊株の作成、遺伝子発現量の確認のための遺伝子工学試薬を購入する。成果発表となる国際誌への論文投稿をめざし、英文校正代と投稿料を必要とする。国内の学会と国外の学会に積極的に参加し、本研究の成果を発表するために出張経費が必要となる。