2022 Fiscal Year Research-status Report
Identification and molecular function of novel acetylcholine receptor gene in plants
| Project/Area Number |
22K05445
|
|---|
| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
|---|
Principal Investigator |
山本 紘輔 東京農業大学, 生命科学部, 准教授 (80803254)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| Keywords | アセチルコリン / アセチルコリン受容体 / 神経伝達物質 / アセチルコリンエステラーゼ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
RI標識したAChRリガンドである[125I]αブンガロトキシン([125I]αBgt)を用いて、リガンドに対して高い結合能を有する植物を選定した。結果として、レモンバーム根の細胞膜画分がリガンドに対して高い結合能を有していた。次に以下の方法で植物AChR様タンパク質の分離を試みた。
方法1: 光親和性標識[125I] αブンガロトキシン(αBgt)を上記細胞膜画分と反応させ、光架橋した。光架橋した試料を電気泳動することでRI標識リガンドが結合したAChR様タンパク質をゲル上で検出した。その結果、約60kDaにバンドが検出された。同様な工程をRI標識していないαBgtを使用して行い、電気泳動後に上記AChR様タンパク質が検出された分子量(約60kDa)と同位置のゲルを回収した。
方法2：レモンバーム根の細胞膜画分を界面活性剤で可溶化し、リガンド固定化アフィニティーカラムにより植物AChR候補タンパク質群を部分精製した。対照区としてリガンドが結合していないカラムにより試料を分離し、非特異吸着タンパク質群を得た。上記2試料を電気泳動に供試し、バンドパターンを比較することで、AChR候補タンパク質群に特異的なバンドを回収した。方法1と同様に、60kDa付近にAChR候補タンパク質群に特異的なバンドを検出することができた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画の7割は完了している。そのため、概ね順調と判断した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
方法1,2で得られた各バンドを LC-MS/MSで分析後、Mascot検索サーバーから受容体様タンパク質をコードする遺伝子を選抜し、植物AChR候補遺伝子群とする。
次に、以下3条件を満たすタンパク質を「植物AChR」と定義し、上述の候補遺伝子群の中からAChR遺伝子を同定する。①動物で既知のAChRの特徴的ドメインを有する。②膜タンパク質の配向性が動物AChRと類似している。③動物AChRのリガンドと結合する。①については、データベースを使用した各受容体候補のアミノ酸配列の解析を行う。②については、各候補遺伝子を供試植物からクローニングし、N末端およびC末端に異なるエピトープタグが付与されるように動物発現用ベクターに連結する。その後、HEK293細胞に各植物AChR候補遺伝子群を形質転換させ、それらの細胞が組換えタンパク質を発現していることをウエスタンブロッティングで検証する。また、それらの細胞膜局在と配向性をFACSで検証する。③については、RI標識AChRリガンドに対する結合能を上述の組換えタンパク質発現細胞と非形質転換細胞で比較する。
|
| Causes of Carryover |
試薬の値上がりにより、当初予定していた購入量よりも少なくなり、822円の余りが出てしまった。次年度822円を合算して、試薬を購入予定。
|
