2022 Fiscal Year Research-status Report
Clarification of apomixis phenomenon and its application by using ASG-1 gene
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22K05588
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| Research Institution | Minami Kyusyu University |
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Principal Investigator |
陳 蘭庄 南九州大学, 環境園芸学部, 教授 (40284822)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山形 悦透 九州大学, 農学研究院, 准教授 (00600446)
杉田 亘 南九州大学, 公私立大学の部局等, 教授 (10503071)
津釜 大侑 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (10726061)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | アポミクシス / ASG-1 遺伝子 / ギニアグラス / シロイヌナズナ / イネ / 胚的発育機構 / 全ゲノムシーケンシング / ゲノム編集(CRISPR/Cas9) |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アポミクシスは、母親の遺伝子型だけが子供に伝わる生殖様式である。この現象を実利用できれば、一代雑種の固定などへの応用が可能となるなど、「緑の革命」以上の経済効果が期待されている。我々はイネ科牧草ギニアグラスを用いてアポミクシスが特異的に発現する遺伝子（ASG-1）の捕捉及び機能解析を行っている。HSP prom.::ASG-1::GFPをシロイヌナズナに導入した結果、アポミクシス様現象が見つかった。本研究では、HSP prom.::ASG-1::GFPを用いて、1)組換えシロイヌナズナにおける多胚嚢と多胚形成の発生機構の解明；2)組換えギニアグラスの作出とその作用機構の解明；３)組換え四倍体イネの作出と機能解析を行い、ASG-1の胚的発育機構の解明とその応用的展開を目指す。
初年度では、１）これまでに開花後の生育ステージの大きな子房しか観察できなかったが、開花前の子房を微分干渉顕微鏡による観察法を確立した。２）（１）まず、有性生殖系統ギニアグラスの種子と子房を用いてそれぞれの植物体再生系を確立した。（２）アポスポリー性ギニアグラス系統のゲノム上のASG-1領域やその周辺配列・遺伝子について情報を得るため、Illuminaのシーケンサーを用いて当該系統の全ゲノムをシーケンシングし、150Gb程度（全ゲノム配列の150倍程度）のリードを得た。これを用いてゲノムアッセンブリを試みたところ、得られたコンティグのサイズは概して小さかったが、ASG-1のタンパク質コード領域の配列の大部分を含むコンティグが得られた。（３）また、ASG-1遺伝子の塩基配列を基に、ゲノム編集(CRISPR/Cas9)コンストラクトを５個作成した。それらをアグロバクテリウムのHA105株にCRISPR-Cas9コンストラクトを形質転換した。３）数品種の四倍体イネの成熟種子から組み換え用のカルス形成が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初の本研究の計画では、HSP prom.::ASG-1::GFPを用いて、1)組換えシロイヌナズナにおける多胚嚢と多胚形成の発生機構の解明；2)組換えギニアグラスの作出とその作用機構の解明；３)組換え四倍体イネの作出と機能解析を行い、ASG-1の胚的発育機構の解明とその応用的展開を目指すことである。
１）では、胚的発育機構の解明には、観察法の工夫により、より若いステージの子房をリアルに観察できるようになっている。ほぼ予定の通り進んでいる。２）では、（１）ギニアグラスの種子と子房を使って植物体再生系を確立した。これも予定の通りに進んでいる。（２）一方、最近の全ゲノム解析技術の進歩に伴い、試しにASG-1由来のアポスポリー性ギニアグラスを用いて全ゲノムをシーケンシングし、150Gb程度のリードを得た。これを基に、令和5年度「先進ゲノム支援 研究支援」を申請している。（３）ASG-1遺伝子の機能解析を効率的に行うため、ゲノム編集(CRISPR/Cas9)コンストラクトを５個作成した。よって（２）と（３）は、当初の計画以上に進んでいると判断した。３）では、ジーンバンクより入手したイネ四倍体数品種を用いてIn Vitro培養で成熟種子よりカルス形成が確認された。この実験も予定の通りに進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の本研究の計画では、HSP prom.::ASG-1::GFPを用いて、1)組換えシロイヌナズナにおける多胚嚢と多胚形成の発生機構の解明；2)組換えギニアグラスの作出とその作用機構の解明；３)組換え四倍体イネの作出と機能解析を行い、ASG-1の胚的発育機構の解明とその応用的展開を目指すことである。
１）については、新たに確立した観察手法を用いてより詳細に発育初期のシロイヌナズナのASG-1組み換え体の胚的発育パターンを解明する。２）については、ギニアグラスの培養系を用いて、アグロバクテリウム菌とゲノム編集(CRISPR/Cas9)コンストラクトの両方より、ASG-1の組み換え体を作出する。また、令和5年度「先進ゲノム支援 研究支援」が採択されれば、ギニアグラスの全ゲノム解析を精力的に推進する。その情報も活かしながら、ASG-1のゲノム領域の配列をPCRとシーケンシングにより決定する。３）については、In Vitro培養で四倍体イネの植物体再生系を確立して、ASG-1の組み換え体を作出する。
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| Causes of Carryover |
引き続き、本研究を続けて行うため、予算を計上する。
計画としては、1)組換えシロイヌナズナにおける多胚嚢と多胚形成の発生機構の解明；2)組換えギニアグラスの作出とその作用機構の解明；３)組換え四倍体イネの作出と機能解析を行い、ASG-1の胚的発育機構の解明とその応用的展開を目指す。
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