2023 Fiscal Year Research-status Report

ウシ乳汁エクソソームにより活性化されるオートファジーの役割解明

Research Project

Project/Area Number	22K05975
Research Institution	Nihon University
Principal Investigator	相澤修日本大学, 生物資源科学部, 講師 (10645899)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	母乳 / エクソソーム / オートファジー / 腸管上皮細胞
Outline of Annual Research Achievements	エクソソームは細胞から分泌・放出される膜小胞であり、生体内においては血液をはじめとするあらゆる体液中に存在することが知られている。哺乳動物の新生児（仔）にとって唯一の栄養源である母乳に関しても、マウスやヒトをはじめ多くの動物種においてエクソソームの存在が確認されている。このことは、生体内における細胞間情報伝達のみならず、母乳を介した母親-新生児（仔）間の情報伝達にもエクソソームが関与することを示唆するものである。また、ウシに関しても母乳中にエクソソームが含まれることが多数報告されており、エクソソーム内に含まれるmiRNAの動物種間における高い配列保存性から、食品として牛乳を摂取したヒトにおけるウシ乳汁エクソソーム内miRNAを介した生理機能調節作用が期待されている。申請者は、ウシ乳汁エクソソームの機能を探索する過程において、腸管上皮細胞株のオートファジーを活性化させることを見出した。本研究では、腸管組織におけるウシ乳汁エクソソームのオートファジー活性化の分子機構と生体内における存在、および腸管組織の恒常性維持におけるその役割を明らかにすることを目的としている。今年度は、培養腸管上皮細胞モデルを用いて乳汁エクソソームの細胞内取り込みメカニズムの解明に迫った。培養腸管上皮細胞に対してエンドサイトーシス関連分子の阻害剤処理や発現抑制を行った結果、乳汁エクソソームの取り込みが顕著に減少した。このことから腸管上皮細胞における乳汁エクソソームの取り込みにはエンドサイトーシス経路が深く関わることが明らかとなった。さらに、昨年度に引き続き、生体における乳汁エクソソームによるオートファジー活性化の存在を明らかにするため、マウス腸管組織におけるオートファジーマーカータンパク質の免疫染色法の検討を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ウシ乳汁より単離・精製されたエクソソームの腸管上皮細胞への取り込みメカニズムを明らかにするため、エンドサイトーシス経路に着目し、その阻害剤処理や関連分子の発現抑制を行った。その結果、腸管上皮細胞へのエクソソームの取り込みが著しく減少した。このことから腸管上皮細胞における乳汁エクソソームの取り込みメカニズムの一端を明らかにすることができた。また、生体レベルにおける乳汁エクソソームによるオートファジー活性化の存在を示す実験に関しては、腸管組織の自家蛍光などの問題もあり、当初の計画通りには進捗しておらず、検出法を酵素抗体法に変更するなどして現在検討中である。さらに、先行研究を参考に、ウシ乳汁から得られたエクソソームの凍結保存法についても検討を行っている。
Strategy for Future Research Activity	令和6年度は、昨年度に引き続き乳汁エクソソームによるオートファジー活性化の生体における存在を明らかにすることを目標とする。マウスに対して単離・精製されたウシ乳汁エクソソームを経口投与し、腸管組織を固定、パラフィン包埋後に組織切片を作製し、LC3タンパク質をはじめとしたオートファジーマーカータンパク質に対する抗体で免疫染色することにより、培養細胞レベルで明らかにした乳汁エクソソームによるオートファジー活性化を生体レベルで示すことを目標とする。さらに、炎症性腸疾患の培養細胞モデルを作製し、乳汁エクソソームの病態改善効果に関して、上皮透過性や炎症性サイトカイン発現などを指標に評価することにより、腸管組織の恒常性維持における役割を解明する。
Causes of Carryover	次年度使用額が生じた理由として、マウス腸管組織の染色に用いたいくつかの抗体が特異性の問題により使用できなかったことや、腸管組織の自家蛍光の問題により検出法を変更せざるを得ないことにより、当初の計画通りに研究が進行しなかったためである。次年度使用額は、主に計画通りに進行しなかった上記実験のために使用する。したがって、上記実験に関連する生化学的解析に使用する消耗品やプラスチック器具類、ガラス器具類など購入する予定である。実験設備は整っているため、現在のところ設備備品の購入予定はない。