ウェルシュ菌産生壊死毒素(NetB)の鶏壊死性腸炎発症に関与する宿主側因子の特定

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K06007
• Research Institution: Osaka Metropolitan University
• Principal Investigator: 向本 雅郁 大阪公立大学, 大学院獣医学研究科, 客員研究員 (80231629)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: NetB / 受容体 / ウェルシュ菌 / 小腸上皮細胞 / ニワトリ / siRNA

Outline of Annual Research Achievements

これまでの研究で作製したLMH細胞の細胞膜に対するモノクローナル抗体の中からNetBのLMH細胞への結合を阻害する抗体を選別した。LC-MS/MSにより、この抗体が認識する分子をNetB受容体候補分子とし、受容体の特定を行った。昨年度はLC-MS/MSの結果からニワトリデータベースを用いて哺乳類との相同性が低いニワトリミクロソームトリグリセリド輸送蛋白（MTTP）とニワトリトランスフェリン受容体蛋白（TFRC）をNetB受容体の第1候補とし解析を行ったが、いずれのsiRNA導入群でもネガティブコントロール群と比較して生存率に有意な違いは見られなかった。この結果より、両分子はNetBの受容体でないことが明らかとなった。
今年度は候補分子としてLC-MS/MSの結果からMTTPとTFRCに次いでニワトリデータベースを用いて哺乳類との相同性が低いS-ギセリン前駆体(Gicerin)、FAM234A蛋白(FAM)、カルシウム活性化クロライドチャネルレギュレーター１(CLCA1)、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ-8(ENTPD8)、Eカドヘリン(Ecadherin)の5種類を選定し、それぞれのsiRNAを3～5種類合成した。CLCA1においてのみ2種類siRNAが90％以上のｍRNA発現抑制を示した。また、LMH細胞にこれらのsiRNAを導入したとき、細胞生存率の減少がみられなかったことから、いずれのsiRNAも細胞の生存・増殖に影響しないことが明らかとなった。終濃度50 nMとなるようsiRNAを導入し48時間後にNetBと24時間反応させた時の細胞生存率について、siCLCA1-2を導入した群はネガティブコントロール群に比較して有意に高い値を示した。このの結果より、今回選定した分子の中ではCLCA1-2が有力なNetBの受容体候補であることが示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

これまでの研究成果からNetB受容体はリン脂質やコレステロールではなく、鶏に特異的な動物種特異性を有していることから、蛋白あるいは蛋白を含む分子であることはほぼ間違いないと考えている。LC-MS/MS解析により100以上のニワトリ由来分子が候補分子としてヒットした。哺乳動物との比較において、MTTPとTFRCは、ヒットした上位10分子の中で最も相同性が低かった。しかしながらsiRNAを用いた抑制実験において、NetBのLMH細胞への結合は抑制されなかった。本研究は網羅的にNetB受容体を探索するものであることから、今年度は哺乳動物との相同性が前者2分子に次いで低い5分子を候補分子として選定した。受容体候補の検出系は昨年度に確立できたので、同様の方法を用いて候補分子の探索を行った。その結果、カルシウム活性化クロライドチャネルレギュレーター１がNetB受容体として非常に有力な分子であるという結果を得ることができた。予定では1年目に到達していなければいけないが、有力な候補分子が特定できたことで、来年度のNetB受容体発見に繋がると考えている。

Strategy for Future Research Activity

NetB受容体の有力な候補分子である可能性が高いカルシウム活性化クロライドチャネルレギュレーター１(CLCA1)とNetBに対する細胞致死作用を有意には抑制しなかったが他の分子に比べて抑制効果が高かったFAM234A蛋白(FAM)の2分子について哺乳動物との相同性の低い領域についてそれぞれ数か所ぺプチを合成し、マウスに免疫することで抗血清を作製する。
哺乳動物細胞用遺伝子発現ベクターと数種類のNetB非感受性である哺乳動物株化細胞を用いてニワトリCLCA1およびFAMを哺乳動物の細胞膜上に発現させる。発現の有無および強さについては抗CLCA1および抗FAM抗体を用いて評価する。発現が確認された後、NetBをCLCA1およびFAM発現株化細胞に添加し、致死活性の獲得の有無についてMTT法により評価する。
時間的な余裕があれば、NetB感受性細胞であるニワトリ肝がん由来細胞株（LMH）においてそれぞれの分子の遺伝子をノックダウンし、NetB感受性の消失を確認する。以上の方法により、NetBに対する細胞側受容体を特定する。

Causes of Carryover

昨年度実施予定の実験について、今年度にずれ込んだため、必要な試薬類はすでに昨年度購入済みであった、今年度実施予定の実験については次年度実施するため、その試薬等の購入に繰越金を充てる予定である。