2023 Fiscal Year Research-status Report
経口減感作による組換えAAVの発現効率の改善―筋ジストロフィー治療を目指して
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22K06064
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
石井 亜紀子 筑波大学, 医学医療系, 客員研究員 (10400681)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
喜納 裕美 (早下裕美) 東京大学, 医科学研究所, 特任助教 (60532728)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 遺伝子治療 / 経口免疫寛容誘導法 / AAV / 筋ジストロフィー / カニクイザル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は，臨床的には高度の筋力低下・筋萎縮，病理学的には骨格筋の変性・壊死を引き起こす平均寿命28歳の重篤な遺伝性疾患である. 根本的な治療法はなく，効果的な遺伝子治療が必要である. これまで応募者の研究グループは，骨格筋に遺伝子を効率的に導入できる組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）を開発し，小型化されたマイクロジストロフィン遺伝子を使用してその治療の可能性を検討してきた．その結果，AAV遺伝子治療成功の鍵となるのは免疫反応のコントロールであることを明らかにし，安全な免疫反応のコントロール法の開発が遺伝子治療の臨床応用に必須であると考えた．免疫抑制剤であるタクロリムスの使用により，導入遺伝子の発現を延長できるという研究結果はすでに報告しているが，さらに安全性の高い免疫寛容を誘導する必要があると考え，本研究を計画した．
将来のDMDの遺伝子治療を目標として，非ヒト霊長類にて羊膜由来間葉系幹細胞による減感作により免疫寛容誘導を行い，導入遺伝子発現を持続させるため，当該年度は，昨年大量調整した遺伝子導入用のrAAVベクターと，KANEKAより共同研究として供与された免疫寛容を誘導するための羊膜由来間葉系幹細胞を用いて，中和抗体陰性の２頭のカニクイザルに対し実験を開始した．当初経口での羊膜由来間葉系幹細胞の投与を予定していたが，確実性を期するため，静脈投与に切り替え，現在まで，４，１６，２４週の生検が終了し，その結果を解析中である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度に，遺伝子導入用のrAAVベクター大量調整と，KANEKAより共同研究として供与された免疫寛容を誘導するための羊膜由来間葉系幹細胞の調整および中和抗体陰性のカニクイザルの選定が終了し，組み換えDNA実験の承認を得た．当該年度は羊膜由来間葉系幹細胞の経口投与については，投与量が安定せず，免疫抑制が不十分であったため、確実性を重視し，静脈投与で減感作を行うこととしたが，カニクイザル２頭に対し，rAAVベクターの投与を開始できた．抗原曝露後のインターフェロンγ産生能の減弱を確認し，免疫応答の誘導を確認した後，rAAV (AAV8CMVLacZ)をカニクイザルの左右の上腕二頭筋，前脛骨筋の計4箇所に直接注入（1x1013 vg/１箇所）した．現在まで，順調に４，１６，２４週の筋生検が終了し，LacZやベクターに対する血清抗体価の測定（ELISAまたはウエスタンブロット法）などの結果の解析中である．
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| Strategy for Future Research Activity |
抗原曝露後のインターフェロンγ産生能の減弱を確認し，免疫応答の誘導を確認した後，rAAV (AAV8CMVLacZ)をカニクイザルの左右の上腕二頭筋，前脛骨筋の計4箇所に直接注入（1x1013 vg/１箇所）した．これまで終了した8,16及び24週後の筋生検でのLacZ発現をPCR法，ウエスタンブロット法及び免疫組織化学染色法を用いて解析する．また，H＆E染色や酸性フォスファターゼ染色などで組織障害の程度も検討する．42週後に最終の筋組織の生検と解剖を行い，LacZ発現をPCR法，ウエスタンブロット法及び免疫組織化学染色法を用いて解析する．各時点で行った採血結果も検討する．
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| Causes of Carryover |
中和抗体陰性カニクイザルの選定後、移管時期がコロナ禍でずれたため、飼育・飼料費が当初の予定より少なくなり、23年度から24年度に持ち越したため。
カニクイザルの飼育費・飼料費,として筋生検，解剖の費用として引き続き使用する予定である。
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