Regulation of cell cycle-dependent microtubule dynamics by the Akt1-EB2/RP1 signaling pathway

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K06134
• Research Institution: Rikkyo University
• Principal Investigator: 樋口 麻衣子 立教大学, 理学部, 准教授 (30420235)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 微小管 / 細胞周期 / 紡錘体

Outline of Annual Research Achievements

微小管は真核生物における主要な細胞骨格の一つで、間期においては中心体から伸びた微小管が細胞質に網目状のネットワークを形成し、細胞内輸送やオルガネラの配向の制御など、多様な役割を果たしている。一方、細胞が間期からM期へ移行する際には、細胞質の微小管ネットワークが素早く崩壊・消失し、代わりに、倍加した２つの中心体を両極とする紡錘体微小管が形成される。このように、微小管は細胞周期の時期に応じてその構造を劇的に変化させ、全く異なる機能を発揮するが、間期からM期へ移行するタイミングで、いかなるメカニズムで細胞質の微小管ネットワークが崩壊・消失するのかについては、ほとんど明らかになっていない。本研究では、PI3K-Akt経路が微小管結合分子EB2/RP1を介してM期移行に伴う微小管ネットワークの再編成を制御する可能性について検討を行った。微小管結合分子EB2/RP1はその機能がほとんど分かっていない分子であったが、研究代表者はこれまでにEB2/RP1がそのファミリー分子EB1とは異なり間期の細胞においては微小管全体に局在すること、また分裂期の細胞においては微小管に局在しないことを見出した。この結果より、EB2/RP1が細胞周期依存的にその局在を変化させる可能性を考えた。これまでに、間期の一部の細胞においてEB2/RP1が微小管上ではなく細胞質にドット状に局在することを見出しており、現在EB2/RP1がドット状に局在する意義とメカニズムについて検討を行なっている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

EB2/RP1の局在と細胞周期の関係について検討を行うため、細胞周期同調実験を行なった。NIH 3T3細胞を、ダブルチミジンブロックによりG1/S期に同調させ、2回目のチミジンからリリースしたところ、比較的良好に細胞周期の同調を行うことが出来た。細胞周期の再開後のEB2/RP1の局在を調べたところ、G2期からM期の時期に、EB2/RP1が微小管上から消失し、ドット状の局在を示す細胞の割合が多くなることが分かった。また、EB2/RP1のドット状局在の正体を明らかにするため、細胞小器官のマーカー分子との共染色を行なったところ、EB2/RP1のドット状のシグナルはペルオキシソームマーカーであるPex14と共局在すること、また一部のEB2/RP1のドット状のシグナルはミトコンドリアマーカーであるTom20と共局在することが分かった。

Strategy for Future Research Activity

EB2/RP1の局在と細胞周期の関係についてさらに詳しく検討するため、蛍光分子でラベルしたEB2/RP1発現細胞のリアルタイム観察を行う。また、EB2/RP1が細胞周期依存的にドット状に局在するメカニズムについても検討を行う。具体的には、EB2/RP1の結合分子の網羅的解析を行い、EB2/RP1の局在制御分子を明らかにしたいと考えている。現在、EB2/RP1の結合分子の網羅的解析を行うために、EB2/RP1安定発現細胞株を作製中である。

Causes of Carryover

細胞周期同調実験に関して、当初予定していたよりも試薬類の使用が少なく済んだため、次年度使用分が生じた。次年度使用額については、当初の研究計画通り、EB2/RP1の局在と細胞周期の関係を明らかにするために必要な生化学的、分子生物学的、細胞生物学的実験を遂行するための消耗品、設備、備品の購入費用として使用する予定である。