2022 Fiscal Year Research-status Report
3分子同時計測による、神経細胞内ATP産生のMg2+による制御メカニズムの解明
| Project/Area Number |
22K06165
|
|---|
| Research Institution | Keio University |
|---|
Principal Investigator |
新藤 豊 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 特任助教 (30449029)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| Keywords | 蛍光イメージング / 遺伝子コード型センサー / ピルビン酸 / ATP / グルタミン酸 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は「ATP産生にかかわる分子2種類およびMg2+の3分子同時計測系を構築し、神経細胞内Mg2+濃度変動がATP産生に与える影響を相関解析から推定し、その因果関係を確かめること」である。初年度は、A, 既存のCFP-YFPペアのFRET型センサーの蛍光タンパク質を入れ替え橙色-赤色のFRET型センサーの開発を進めた。また、B, 分散培養したラット海馬神経を、脳内で主要な興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸で刺激した際の細胞内Ca2+, Mg2+濃度変化を測定し、刺激グルタミン酸濃度や神経細胞の成熟とそれらのイオンの濃度変化の関係性について調べた。
A：既存の乳酸センサー、ピルビン酸センサーを基に、蛍光タンパク質を入れ替えたものを複数種類作製し、HeLa細胞に発現させて性能を確認した。乳酸センサーは乳酸濃度変化によりFRET比を大きく変化させるものがなかったが、ピルビン酸センサーでは1つの候補で細胞内のピルビン酸濃度変化に応じたFRET比の変化が確認された。これを橙色-赤色ピルビン酸センサーのプロトタイプとし、今後の性能評価へと進める予定である。また、本研究開始以前から開発していた橙色-赤色ペアのFRET型ATPセンサーについても、性能評価実験および、論文発表の準備を進めた。
B：培養期間の異なる神経細胞を、それぞれ1, 10, 100, 500マイクロMのグルタミン酸で刺激した際の応答を観察した。2週間程度培養し、ある程度成熟した神経細胞では1マイクロMのグルタミン酸であってもMg2+濃度上昇を引き起こすこと、10マイクロM以上では神経細胞死に関連するMg2+濃度減少が起こってしまうことを発見した。これらの結果から、培養1週間程度の未成熟な神経では10～100マイクロM程度、成熟した神経では1～10マイクロM程度のグルタミン酸が刺激に適切であることが分かった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画において初年度は、橙色－赤色のFRET型センサー開発の目途を立てることと、エネルギー代謝とMg2+の関係を調べるための準備として神経興奮とMg2+濃度変化の関係を詳細に調べておくことの2点を行うことになっていた。FRET型センサーの開発については前項でも説明した通り、橙色－赤色のピルビン酸センサーのプロトタイプの開発に成功したことで目標ラインをクリアしたと言える。同時使用で用いる2種類のFRET型センサーの組み合わせの幅を広げるために、同時に橙色－赤色の乳酸センサーの開発も行ったがこちらはうまく機能するものが得られなかったため、計画以上の成果を出せたわけではないが、研究を先に進める上でクリアすべきラインを超えることができたと評価できる。
また、2年度目以降の実験のために神経活動と細胞内Mg2+動態の関係を詳細に調べておくことに関しては、神経細胞の成熟や刺激に用いたグルタミン酸の濃度とMg2+濃度変化の関係を詳細に調べ、Ca2+濃度変化（神経活動の指標としている）との関係性を解析し、今後に実験に最適と思われる刺激条件を選定することができた。当初の計画でもそこまでを初年度に行う予定であったことから、この点に関しても概ね計画通りに進めることができていると評価できる。
総合して、当初の計画と照らし合わせて、順調に研究を進めることができていると考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
2年度目は以下の2点を進める計画になっている。
新規開発した橙色－赤色のFRET型センサーの評価と改良：初年度に開発に成功した橙色－赤色のピルビン酸センサーの性能を評価する。大腸菌にセンサータンパク質を大量に作らせ、それを抽出・精製したサンプルを用いることでセンサーとしての基本性能を確認する。ここで問題があった場合や、改良により更なる性能向上の可能性が見いだされた場合はこのプロトタイプを基に遺伝子変異を加えたセンサーを作製しその性能と比較する。また、これまでに開発したATPセンサーおよびピルビン酸センサーを論文発表することを目指す。
3分子同時計測：本研究では近赤外蛍光のMg2+プローブと併用することにより細胞内エネルギー代謝にかかわる3種類の分子の同時計測を実現するために、ATP・ピルビン酸・乳酸・グルコースの4種類の分子の中から2種類毎の同時計測をFRET型センサーで可能にする必要がある。ここまでに、赤色－橙色のATPセンサー、ピルビン酸センサーの開発に成功しているので、これらと他の分子の組み合わせによる同時測定可能となったことになる。3分子の同時計測に先駆けて、2種類のFRET型センサーを同時使用することで実際にそれぞれのシグナルを独立に測定できているのかの検証を行う。その確認が取れたら、さらに近赤外蛍光のMg2+センサーKMG-501も併用した3シグナル同時測定を行う。まずはそれぞれのセンサーの導入量や計測条件の検討など、基本的な実験条件を固めるところから行う。2年度目の中旬には安定な3分子同時測定条件の確定を行い、後半にはその後の相関分析に進めることのできるデータの取得ができるようにすることを目指す。
|
| Causes of Carryover |
本年度は研究が順調に進み、計画額の予算範囲内で必要な物品がそろったために、結果として未使用額が出た。繰り越した金額は、翌年度分と合わせて物品費として使用する計画である。
|
