2022 Fiscal Year Research-status Report
ポリリン酸はなぜ液胞に隔離されている？－細胞質ポリリンによる細胞機能障害の解明－
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22K06212
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| Research Institution | Nagahama Institute of Bio-Science and Technology |
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Principal Investigator |
向 由起夫 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 教授 (60252615)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ポリリン酸 / 細胞寿命 / 細胞増殖 / 液胞 / 細胞質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
無機リン酸のポリマーであるポリリン酸は細胞内のオルガネラである液胞で合成・蓄積される。これまでに、出芽酵母においてポリリン酸を高度に蓄積させると、分裂寿命（１個の細胞が死ぬまでに分裂する回数）が短くなること、および細胞増殖が遅くなることを見出した。さらに（液胞外の）細胞質ポリリン酸の増加がこれらの細胞機能障害の原因であることを示す結果を得ている。本研究課題では、細胞質のポリリン酸がこれらの細胞機能に障害を与える作用機序を解明することを目的とした。本研究の成果から、ポリリン酸の新しい生理機能を明らかにするとともに、ポリリン酸がなぜ液胞に隔離されているのかを理解することが期待できる。
出芽酵母で大腸菌ポリリン酸キナーゼEcppk1遺伝子を発現させると、細胞質ポリリン酸が増加することにより、分裂寿命が短くなり、細胞増殖が遅くなる。2022年度は、この細胞質ポリリン酸の増加による短寿命あるいは増殖遅延の原因を知るために、Ecppk1発現株の増殖遅延を抑圧する遺伝子を「多コピープラスミド」と「遺伝子破壊」の2つのアプローチで分離した。また、トランスクリプトームおよびメタボローム解析により、Ecppk1発現株における細胞内変動を調べた。出芽酵母で得られた知見をヒト細胞でも確認することを目指し、ヒト老化細胞においてポリリン酸が増加するかどうかを検証するために、出芽酵母と同様に有限寿命をもつヒト胎児肺由来 WI-38細胞を継代培養し、分裂寿命（細胞集団倍化数 PDL）を確認するとともに、段階的な老化細胞を取得する実験系を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究課題では、細胞質ポリリン酸を増加させるために、大腸菌ポリリン酸キナーゼEcppk1遺伝子を酵母で発現させた。Ecppk1発現株では、分裂寿命が著しく短くなり、細胞増殖が遅くなる。本研究では、次の3つの研究を計画・実施した。
A. 細胞質ポリリン酸の増加による短寿命あるいは増殖遅延の原因の探索： Ecppk1発現株の増殖遅延を抑圧する遺伝子を「多コピープラスミド」と「遺伝子破壊」の2つのアプローチで分離・同定した。それらはミトコンドリアや細胞壁に関係する遺伝子を含んでいた。また、トランスクリプトームおよびメタボローム解析により、Ecppk1発現株においてアミノ酸に関係する代謝変動を見出した。
B. 細胞質ポリリン酸の増加量の検証： 細胞機能障害を示す株における細胞質ポリリン酸の増加量を免疫電子顕微鏡観察によって評価することを提案したが、その実験に用いる急速凍結置換装置が稼働しないことが判明し、他の評価方法を検討しなければならなくなった。また、ポリリン酸を検出するためのプローブとして、大腸菌ポリリン酸ホスファターゼのポリリン酸結合領域にエピトープタグを付加した組換えタンパク質を大腸菌で発現させたが、可溶化させることができなかった。
C. ヒト細胞におけるポリリン酸増加による細胞機能障害の検証： ヒトの老化細胞におけるポリリン酸量を測定するために、有限寿命をもつヒトWI-38細胞を継代培養することにより、分裂寿命（細胞集団倍化数 PDL）を確認するとともに、段階的な老化細胞を取得する実験系を確立することができた。
以上のように、計画AとCは予定通り進んでいるものの、計画Bを進めることができなくなったために、自己評価を「やや遅れている」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究課題を推進するために、2023年度は次のような方策を計画している。
A. 細胞質ポリリン酸の増加による短寿命あるいは増殖遅延の原因の探索： Ecppk1発現株の増殖遅延を抑圧する多コピー遺伝子および遺伝子破壊が、Ecppk1発現株の短寿命も抑圧することを確認する。この作業と並行して、同定した遺伝子の既存情報から、細胞質ポリリン酸が細胞増殖や分裂寿命を障害する原因を推定する。また、Ecppk1発現株で発現が増減した遺伝子について、それが増殖あるいは寿命に関係することを遺伝学的に検証する。さらに、Ecppk1発現株において変動していたアミノ酸関連物質が細胞機能にどのような影響を与えるかについても検証する。
B. 細胞質ポリリン酸の増加量の検証： 当初予定していた細胞質ポリリン酸の増加量を免疫電子顕微鏡観察によって評価することが困難となったため、ポリリン酸結合タンパク質を用いた間接蛍光法により、ポリリン酸の局在を観察する方法を確立する。液胞に大量に蓄積するポリリン酸の影響を除くために、液胞ポリリン酸ポリメラーゼVTC4遺伝子破壊株を用いて、液胞のポリリン酸をなくすようにする。この実験系のためにも、ポリリン酸を検出するためのプローブ作製を急務とする。
C. ヒト細胞におけるポリリン酸増加による細胞機能障害の検証：有限寿命をもつヒトWI-38細胞における段階的な老化細胞を取得し、老化に伴うポリリン酸の蓄積状況を調べる。また、WI-38細胞におけるEcppk1誘導発現株を樹立し、ヒト細胞でEcppk1を発現させたときにも分裂寿命が短縮するかどうかを確認する。
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