2022 Fiscal Year Research-status Report

The role of CAPS in the activity-dependent dense-core vesicle exocytosis: function and impairment

Research Project

Project/Area Number	22K06447
Research Institution	Tokyo University of Science
Principal Investigator	古市貞一東京理科大学, 理工学部応用生物科学科, 教授 (50219094)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	篠田陽東京薬科大学, 薬学部, 准教授 (80403096) 定方哲史群馬大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (90391961) 前澤創東京理科大学, 理工学部応用生物科学科, 准教授 (90548174)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	膵外分泌 / 腺房細胞 / CAPS2 / Cadps2 / エキソサイトーシス / 分泌顆粒 / 慢性膵炎 / アミラーゼ
Outline of Annual Research Achievements	研究の目的：本研究では、エキソサイトーシスの促進に関わる分泌制御因子CAPS/Cadpsに着目し、神経細胞／神経内分泌細胞／膵内外泌細胞におけるシナプス小胞／有芯小胞のエキソサイトーシスとその欠損で発症する病態との関連を明らかにすることを目的としている。研究の内容と背景：2022年度は、3種類の遺伝子改変マウスCadps2 KOマウス、膵臓特異的Cadps2 cKOマウス（Ptf1a-Creマウス×Cadps2 floxマウス）、exon3欠損型Cadps2-dex3マウスを利用して、膵臓外分泌細胞（腺房細胞）におけるCAPS2/Cadps2依存的な分泌顆粒（チモーゲン顆粒）のエキソサイトーシスと、その障害による膵疾患の発症との関連について主に研究を行った。研究成果：CAPS2欠損は、膵腺房細胞内における分泌顆粒の生成と輸送経路の微細形態の異常、分泌顆粒の異常な細胞内蓄積などを引き起こし、血清アミラーゼ活性の低下、腺房の萎縮や細胞死、脂肪細胞や間質細胞の増加、線維化の亢進、免疫細胞の浸潤など、膵炎様症状を引き起こすことが明らかとなった。また、膵臓特異的Cadps2 cKOマウスも同様の病態を示すことから、膵臓におけるCAPS2欠損が主因であると示唆された。さらに、非アルコール性のヒト慢性膵炎患者において稀なCADPS2遺伝子変異型p.Met224Valを同定した。この変異部位はexon3にあり、Cadps2-dex3マウスも膵腺房細胞の異常を示すことを実証した。意義と重要性：膵腺房細胞のエキソサイトーシス機能は食物代謝に不可欠であり、その機能不全は膵炎発症につながる。本研究の成果は、CAPS2/Cadps2が膵外分泌調節に重要な役割をもち、膵疾患の危険因子の一つであることを示唆する。また、Caspd2 KOマウスは、慢性膵炎や膵外分泌不全のモデルになると期待される。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究の目的である①エキソサイトーシスにおけるCAPSタンパク質の役割と、②CAPSタンパク質機能の欠損による疾患との関連性について、3種類のCadps2遺伝子改変マウスを用いた膵外分泌を担う腺房細胞の研究によって、膵外分泌における消化酵素アミラーゼを含有する分泌顆粒のエキソサイトーシスにおけるCAPS2/Cadps2の機能的な役割を示すことができ、またその欠損は慢性膵炎様の症状発症の原因になることを明らかにすることができた。さらに、ヒト慢性膵炎患者よりCADPS2遺伝子変異を同定し、変異部位のexon3を欠損するCadps2発現マウスも同様の細胞異常を発症することを実証することができた。これらの研究成果は、学術雑誌に発表することができた。また、オキシトシン分泌と発達障害におけるCAPS2/Cadps2の関連性に関する総説を学会誌に発表することができた。以上のことから、順調に研究が進展していると考える。
Strategy for Future Research Activity	これまでの研究成果を踏まえ、マウスにおけるCAPS2/Cadps2遺伝子の欠損が引き起こす膵炎様病態に関連する遺伝子発現を明らかにするため、KOマウス膵臓におけるトランスクリプトーム解析を行う。これによって、CAPS2/Cadps2欠損によって発症する膵炎様の病態に関わる分子機構についての理解を深める。また、中脳ドーパミン産生細胞におけるエキソサイトーシスについて研究を進める計画である。CAPS2は中脳の腹側被蓋野と黒質緻密部のドーパミン産生細胞に発現することがわかっている。ドーパミンはシナプス小胞(SV)に取り込まれてシナプス伝達に関わる他、有芯小胞(DCV)にも取り込まれて傍分泌や自己分泌による制御も行う。本研究では、主に細胞体や近位樹状突起周辺の有芯小胞のエキソサイトーシスにCAPS2が関与するのかについて解析する。Cadps2 KOと野生型マウスから調製した初代ドーパミン培養細胞を用いて、疑似蛍光神経伝達物質FFN511をモノアミントランスポーターVMAT2によって小胞に充填させて、蛍光イメージングの比較解析を行う。
Causes of Carryover	各種分解酵素の豊富な膵臓から抽出したサンプルの品質に問題があり予定していた解析が難しかったため、次年度に再度サンプリングして解析することに計画を変更しその予算を残金とした。また、研究成果の発表のため今回採択された学術誌の論文掲載料は、ちょうど円ドル換算が異様に悪化していた時期で支払い請求額が高額で予算オーバーとなるため、他の予算を使用して対応した。このため、確保していた当該予算を残金として次年度の研究に活かす判断をした。