肺神経内分泌細胞とエンドセリン系に着目した慢性閉塞性肺疾患の病態の解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K06608
• Research Institution: Kobe Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 鈴木 陽子 神戸薬科大学, 薬学部, 助手 (70448182)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 肺神経内分泌細胞 / エンドセリン / 慢性閉塞性肺疾患

Outline of Annual Research Achievements

エンドセリン-2（ET-2）の生理学的・病態生理学的役割は不詳である。ET-2遺伝子欠損マウスは出生後に肺の形成不全をきたすため、応募者は肺に着目して予備的実験を進め、成体でET-2と肺神経内分泌細胞（Pulmonary Neuroendocrine Cells; PNEC）の関係を示唆する結果を得た。そこで、「PNECが外環境の酸素濃度を感知してET-2を介して肺胞の恒常性維持に重要な役割を果たしており、その破綻が慢性閉塞性肺疾患の病態を形成する」という仮説を構築した。
当該年度はET-2flox/floxマウスとPNEC特異的プロモーターでCreERTを発現するAscl1-CreERTマウスを交配してPNEC特異的ET-2遺伝子欠損マウスを作出した。8週齢のPNEC特異的ET-2遺伝子欠損マウスにタモキシフェンを投与してPNECで時間依存的にET-2遺伝子を欠損したマウスを作出した。タモキシフェン投与後、8週間まで観察し、呼吸状態含め外表上明らかな異常を示すことはなかった。8週目に屠殺したマウスの肺においてET-2 mRNAの発現が対照マウスに比べて低下していることを確認した。
まず、このマウスで外環境の酸素濃度変化によるET-2発現の変化を検討することでPNECが外環境の酸素濃度を感知してET-2が産生されるか否かを確認したところ、PNECでET-2遺伝子を欠損したマウスでは、酸素濃度の変化に伴うET-2発現の変化は消失したことを確認した。
また、エラスターゼ投与によるCOPDモデルの作成の予備実験として、野生型マウスを用いて条件検討を行い、マウス用プレチスモグラフィを用いて、呼吸機能をモニタリングおよび組織学的検討からCOPDモデル作成を確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画した研究は順調に進捗しているため。

Strategy for Future Research Activity

今後は、PNEC特異的ET-2欠損マウスをタモキシフェン処理後、4週目、8週目にマウス用プレチスモグラフィを用いて、呼吸機能をモニタリングする。その後にマウスを屠殺し、肺を摘出後、肺胞構造並びに肺血管についてHE染色および免疫組織学的手法を用いてCOPDに特徴的な所見について組織学的に検討する。対照群としてET-2flox/floxマウスを用いて比較する。上記の方法でCOPDに類似した表現型を再現できれば、COPD発症におけるPNECの関与を遺伝的に証明できる。
COPD発症におけるPNECとET-2の関連を明らかにできた場合、その分子メカニズムの解明に着手する。タモキシフェン処理後のET-2flox/flox; ROSA26-CreERTマウスから調製したRNAを用いて、シングルセルRNAシークエンス解析を実施する。ET-2遺伝子を欠損させることによって肺で変化する少数細胞の発現遺伝子を網羅的に抽出し、表現型発現に関与する重要な細胞クラスタや情報伝達経路を同定する。さらにAir-Liquid Interface培養系やex vivoでの肺組織培養系に各経路に対する受容体拮抗薬や阻害薬を用いて上記で明らかになった細胞クラスタや情報伝達経路について分子レベルで解析したい。

Causes of Carryover

マウスの表現型解析において、予想したよりも少数の検体で期待された結果を得ることができたため、物品費が減額できた。来年度はその減額分をシングルセルRNAシークエンスに要する費用に充当して、成果を期待したい。