アダプタータンパク質とPDZタンパク質の相互作用がもたらすCDC-48の機能制御

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K06886
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 山中 邦俊 熊本大学, 発生医学研究所, 准教授 (90212290)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: AAAシャペロン / CDC-48 / PDZドメイン

Outline of Annual Research Achievements

CDC-48は、極めて多岐にわたる機能に関わるAAAシャペロンである。Nドメインアダプター（20数種類）がそれぞれに特異的な基質を認識し、 C末端アダプター（数種類）が基質をどのように処理するかを規定している。しかしながらどのようにしてNドメインアダプターは自身の「特異的基質」を探し出すのかはいまだに明らかではない。線虫NドメインアダプターASPS-1の機能解析を行う過程で、ASPS-1-CDC-48複合体が、寿命や匂い感知機能に関わっていることを見出している。さらにそれぞれの経路において、PDZ結合モチーフタンパク質やPDZドメインタンパク質と相互作用することも発見している。
まずCRISPR/Cas9法によりN末にFLAGタグを付加したASPS-1を発現する線虫を構築した。FLAGタグを利用した免疫沈降を行い、共沈物質のマス解析を行なった。DAF-18をはじめとするPDZドメインタンパク質は検出されなかった。逆にHAタグを付加したDAF-18を発現する線虫も構築し、同様に免疫沈降・共沈物質のマス解析を行ったが、ASPS-1やCDC―48は検出されなかった。PDZドメインタンパク質はASPS-1-CDC-48複合体の基質であるので、結合は弱くかつ一過的であると予想されることから、想定されることでもある。ユニークなことに、ASPS-1を免疫沈降した時にCDC-48は確かに検出されたが、CDC-4のさまざまなアダプターのどれもが検出されなかった。UFD-1に関しては、ウエスタンブロッティングによっても確認した。これは、ASPS-1は報告にあるようにCDC-48の解体因子でありデフォルト化に機能している可能性を示唆している。
また、ASPS-1を対象とした免疫沈降実験から、翻訳にかかわる因子やリボソーム品質管理に関わる因子がいくつも検出された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

CRISPR/Cas9法を用いて、現時点で必要とされるタグ付きタンパク質を発現する線虫株を構築することができ、それらを用いた免疫沈降実験も進行しており、今後はそれらの結果解析に進めることができる。

Strategy for Future Research Activity

ASPS-1を対象とした免疫沈降実験から、CDC-48は検出できたがそのアダプターはどれも検出できなかったことから、ASPS-1はCDC-48の解体因子でありデフォルト化に機能している可能性が示唆された。このことから、ASPS-1を対象とした免疫沈降とCDC-48を対象とした免疫沈降を行いそれらの共沈物質を、マス解析・ウエスタン法・ブルーネイティブ電気泳動法などにより、ASPS-1の存在有無でCDC-48の存在様式にどのような変化が生じるかを検証する。また、共沈物質に寿命・匂い感知・糖利用に関する因子が含まれているかを比較検討する。これまでにASPS-1と関わりがあると示された因子の変異をこれらの線虫に導入し、共沈物質にどのような変化をもたらすかを検証する。
ASPS-1を対象とした免疫沈降実験から、翻訳にかかわる因子やリボソーム品質管理に関わる因子がいくつも検出されたことから、これらとの関わりを検証していく。

Causes of Carryover

次年度繰越額は、3,137円であり交付額の支出は問題なく遂行され、次年度の使用計画に変更はない。