2022 Fiscal Year Research-status Report
Application study for quantitative metabarcoding analyses of intestinal protozoan flora
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22K07039
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
所 正治 金沢大学, 医学系, 准教授 (30338024)
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2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 腸管寄生原虫 / 腸内原虫叢 / 次世代シーケンサー / メタバーコーディング / アンプリコンシーケンス解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腸内微生物叢を対象とした次世代シークエンサー（NGS）を用いたメタゲノム解析の発展によって、腸内細菌叢では宿主恒常性維持におけるその重要な役割が次々と明らかになってきた。しかし、腸管寄生原虫のメタバーコーディングは病原性原虫をターゲットとした一部の試みをのぞき、ほとんど実施されていない。コマーシャルベースで使用されているメタ解析のための真核生物ターゲットのアンプリコン解析の系としては、真性菌類のプライマーがあるが、これは寄生虫遺伝子と必ずしもマッチせず、また、ミトコンドリアDNAを狙った真核生物プライマーは、ミトコンドリアDNAを寄生適応にともない喪失している原虫がいるため使用不可である。そこで、本研究では、寄生原虫に最適化した真核生物ユニバーサルプライマーを設計し腸内原虫叢の評価系を確立、もって途上国の分子疫学調査に活用する。
初年度（2022年度）は、既採取済み途上国糞便サンプル（人および家畜家禽・伴侶動物由来）からの精製 DNAを材料に、レファレンスがそろっていない、Chilomastix mesnili、Enteromonas hominis、Dientamoeba fragilis、Endolimax nanaの18S小サブユニットリボソームRNA遺伝子 (18SrRNA)の部分配列を増幅し、約1,600bpのシークエンス情報を確定解析し、また、この解析を通じて明らかとなった各原虫の遺伝的種内多型およびそのクラスター分類に関する考察について博士課程学生が学会発表をおこなった。
病原性寄生原虫のゲノムデータなどを含むレファレンスデータと、上記、詳細評価済みの18SrRNA領域のDNAシークエンスによってほぼ網羅的に腸内原虫叢を構成する全種のDNA情報が準備できたことから、現在、腸内原虫叢をターゲットとした新規ユニバーサルプライマーの候補配列の選定を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
18SrRNA領域のレファレンス配列が欠落していた各種非病原性腸管寄生原虫についてDNA配列の収集を進めてきたが、種内に極めて高度な多型（欠失・挿入部位など）を保持する種などもあり、ターゲット領域の決定、解析に想定外に時間がかかっている。このため、年度内に終了予定だったNGS用の新規ユニバーサルプライマーの設計は次年度も継続することとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
2023年度には、まずNGS用の新規ユニバーサルプライマーの候補領域選定を完了し、その後、選定した新規ユニバーサルプライマーの効果を代表検体（複数の腸管寄生原虫による重複感染検体）を対象としたNGSによる18SrRNAアンプリコンシークエンス解析によって検出の網羅性を定量的に評価する。
また、各原虫特異的プライマーをもちいたリアルタイムPCRによる半定量的解析の準備を進め、NGSのアンプリコン解析でのリード数と比較することで、各新規ユニバーサルプライマーの定量精度を評価する。
年度中に、網羅性・定量性に優れた腸内原虫叢検出・定量のための18SrRNAアンプリコンシークエンス解析用新規ユニバーサルプライマーを確定する。
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