2023 Fiscal Year Research-status Report
Clinical application of biomarkers such as Chromogranin B in Parkinson's syndrome
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22K07397
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
瀧川 洋史 鳥取大学, 医学部, 講師 (30511373)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 脳神経内科学 / 老年医学 / 神経変性疾患 / 分子生物学 / 進行性核上性麻痺 / 大脳皮質基底核変性症 / パーキンソン症候群 / バイオマーカー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
パーキンソン症候群(PS)は，原因不明の進行性の神経変性疾患であり，未だに有効な治療法はない．PSでは多彩な臨床像のために臨床診断が困難な場合が少なくない．脳脊髄液を用いた網羅的な質量分析，血清中のmicroRNAを用いたアレイ解析等によってPSのひとつである進行性核上性麻痺（PSP）に特異的なバイオマーカー候補としてChromogranin B(CHGB)，アミロイド前駆タンパク（APP）を含めた複数の候補分子，疾患特異的microRNA候補を得てきた．本研究では，早期診断，病態解明，治療戦略に資するバイオマーカーを確立することを目的としている．
CHGBのバリアントであるbCHGB_6255が，PSPにおいて特異的な変化を示しており，bCHGB_6255のアミノ酸配列を同定するために神経系培養細胞（SH-SY5Y）より回収したライセート，ヒトの脳脊髄液からの免疫沈降法による精製を試みたが，標的分子が非常に微量であるために解析するのに十分量を得られていない．
APPのN末側，C末側に対する抗体を用いたWestern blotting法によって得られたPSPに特異的な変化を示す2種類のバリアントについて多数例での解析を進めた．
PSP特異的microRNAについては，血清中microRNAを用いたRT-qPCRによる検証研究にてmiR-XXXがPSP群において対照群と比較して高発現を認めた．剖検脳組織を用いた解析では，PSPの神経変性領域におけるmiR-XXXの発現を確認した．また，miR-XXXと臨床像との解析を進めた．一方，microRNAに関するデータベース解析では，タウタンパク質のリン酸化に関する遺伝子が，miR-XXXの標的遺伝子として報告されており，SH-SY5Y細胞を用いた実験においてmiR-XXX強制発現によってリン酸化タウタンパクが抑制されることが確認された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
CHGBについては，バリアントのひとつであるbCHGB_6255がPSPのアミノ酸配列の同定するために神経系培養細胞より回収したライセート，タグを付したCHGBを強制発現させた神経系培養細胞より回収したライセート，あるいは，ヒトの脳脊髄液からの免疫沈降法による精製を試みてきたが．標的分子が非常に微量であるために解析するのに十分量を得ることは非常に困難であった，抗体の選定，試薬やライセート量などの条件設定を検討するために進捗が遅れた．
また，microRNAに関する検証では，血清由来のmicroRNAにおいてPSP特異的に発現を示すmiR-XXXを同定したが，剖検脳により中枢神経系での発現に関する検討では，RT-qPCR，あるいは，in situ hybridization，免疫組織化学染色による二重染色による解析では十分な結果が得られておらず，試薬や条件設定を検討するために進捗が遅れている．一方，培養細胞を用いたmiR-XXXの機能解析については，miR-XXXの強制発現が安定しないこと，強制発現後の培養細胞から回収したラセートを用いたWestern blottingなどによる十分な解析系が確立できず，進捗が遅れた．
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| Strategy for Future Research Activity |
CHGBについては，神経系培養細胞より回収したライセート，タグを付したCHGBを強制発現させた神経系培養細胞より回収したライセート，あるいは，ヒトの脳脊髄液からの免疫沈降法などによる精製，アミノ酸の同定を引き続いて行う．
また，PSPでは神経細胞内での異常リン酸化タウの凝集体形成が病態に関与していると推測されている．CHGBを強制発現させた神経系細胞内でのタウタンパクの変化について抗タウ抗体によるWestern blotting，免疫染色等による解析を進め，CHGBの機能解析，PSPの病態との関連を解析する．
APPのN末側，C末側に対する抗体を用いたWestern blotting法によって得られたPSPに特異的な変化を示す2種類のバリアントについて多数例での解析を継続する．
一方，microRNAに関しては，剖検脳から抽出したqPCRによる解析を継続する．PSPの神経変性においてタウタンパクの凝集体形成が特徴的とされているためmicroRNAの局在，あるいは，タウタンパクとの関連をin situ hybridization，免疫組織化学染色による二重染色にて解析する．SH-SY5Y細胞を用いた機能解析を継続し，miR-XXXを強制発現することによるRNAの発現変化をRNAアレイにて解析し，標的遺伝子機能解析を同定する．
また，質粒分析で疾患特異的な変化を示した他のバイオマーカー候補については，ELISA法などによって検証実験を進める．
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| Causes of Carryover |
PSPに特異的なバイオマーカー候補であるCHBGのバリアントのひとつであるbCHGB_6255の同定に時間を要しているために多数例での検証研究を予定がずれ込んだ．
また，バイオマーカー候補であるmicroRNAについては，剖検脳組織での解析，培養細胞内での強制発現による機能解析を行っているが，安定した解析系の確立に時間を要している．
解析条件の検討を行いながら進めているために本研究費の次年度使用額が生じた．
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Research Products
(32 results)
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[Journal Article] Clinical course of pathologically confirmed corticobasal degeneration and corticobasal syndrome2023
Author(s)
Aiba I, Hayashi Y, Shimohata T, Yoshida M, Saito Y, Wakabayashi K, Komori T, Hasegawa M, Ikeuchi T, Tokumaru AM, Sakurai K, Murayama S, Hasegawa K, Uchihara T, Toyoshima Y, Saito Y, Yabe I, Tanikawa S, Sugaya K, Hayashi K, Sano T, Takao M, Sakai M, Fujimura H,Takigawa H, et al.
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Journal Title
Brain Communications
Volume: 5
Pages: 1～19
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] 眼球運動障害,眼瞼下垂,頸部筋力低下を呈し抗ミトコンドリアM2抗体,抗titin抗体が陽性であった筋炎の一例2023
Author(s)
松本正太, 河瀬真也, 竹内裕彦, 柴田曜, 佐桑真悠子, 田尻佑喜, 足立正, 瀧川洋史, 西野一三, 花島律子
Organizer
第113回日本神経学会中国・四国地方会
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[Presentation] Ono Y,Takekoshi A,Yoshikura N,Takigawa H,Aiba I,Hanajima R,Kowa H,Kanazawa M,Tokuda T,Aya Tokumaru M,Morita M,Hasegawa K,Nakashima K,Ikeuchi T,Kimura A,Shimohata T,JALPAC Study Group2023
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