2023 Fiscal Year Research-status Report
初代培養した癌関連線維芽細胞の分子間相互作用による癌増殖／浸潤メカニズムの解明
| Project/Area Number |
22K08245
|
|---|
| Research Institution | Fujita Health University |
|---|
Principal Investigator |
平松 範子 藤田医科大学, バイオリソース室, 技術員 (10802209)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 直樹 藤田医科大学, バイオリソース室, 教授 (00267957)
近藤 征史 藤田医科大学, 医学部, 教授 (00378077)
今泉 和良 藤田医科大学, 医学部, 教授 (50362257)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| Keywords | 非小細胞肺癌 / 癌関連線維芽細胞 / CAF / 単球 / iPS細胞 / 血管内皮細胞 / 不死化細胞 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、非小細胞肺癌（NSCLC）患者の癌組織から分離した癌細胞および癌関連線維芽細胞（cancer associated fibroblast：CAF）を培養して、iPS細胞作製技術を応用したCAFの由来細胞の検証、増殖制御可能なTet-On不死化技術を応用した特異的CAFマーカーの探索、遺伝子工学的なCAFマーカーの発現変化によるNSCLC細胞の増殖・浸潤への影響の検討、さらにiPS細胞由来リンパ球との共培養による癌細胞のviabilityに関するCAFの影響を検討して、プレシジョン医療への応用をめざす橋渡し研究である。
昨年度までの成果から、癌細胞から分泌される液性因子により間接的に血管内皮細胞からCAFに形質転換される可能性と、血管内皮細胞および形質転換されたCAFから分泌される液性因子が癌幹細胞の生存維持に関わる可能性が示唆されたが、CAFとして証明するための細胞特性や詳細な分子機構についてさらなる検討が必要であった。
2023年度の研究実績として、昨年度に樹立したNSCLC患者の癌細胞株、および同一患者の末梢血単球から作製した単球由来iPS細胞（M-iPS細胞）を用いて、M-iPS細胞から血管内皮細胞に分化誘導し、セルカルチャーインサートを用いた癌細胞との共培養実験とin vitro血管チューブの形成を行い、共培養後の癌細胞および血管チューブ構成細胞について、RNA-sequencingによる網羅的解析を実施した。RNA-Seqの測定結果についてGene ontology (GO) 遺伝子オントロジー解析等を実施したところ、癌細胞と共培養してTube formationさせた細胞は、共培養しなかった細胞よりも、血管発生や血管形成等に関連・機能性を有するRNAの発現量が増加していたことから、癌細胞と共培養することで、新生血管の発生・分化が促進されることが示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2023年度の当初計画は、NSCLC患者の臨床材料から分離培養したCAFを用いて、増殖制御可能なTet-On不死化CAFを作製し、トランスクリプトーム解析やプロテオーム解析による特異的CAFマーカーを探索する予定であった。研究の進捗がやや遅れている理由としては、研究代表者が年度の途中から産前産後・育児休暇を取得したためと、血管内皮細胞からCAFに形質転換される可能性と癌細胞との関連性をより深く追及するために下記の追加実験を実施したためである。
2023年度は、昨年度に樹立したNSCLC患者の癌細胞株、および同一患者のM-iPS細胞を用いて、M-iPS細胞から血管内皮細胞に分化誘導し、セルカルチャーインサートを用いた癌細胞との共培養実験とin vitro血管チューブの形成を行い、共培養後の癌細胞および血管チューブ構成細胞について、RNA-sequencingによる網羅的解析を実施した。RNA-Seqの測定結果についてGene ontology (GO) 遺伝子オントロジー解析、KEGG pathway解析等を実施したところ、癌細胞と共培養してTube formationさせた細胞は、共培養せずにTube formationさせた細胞よりも、血管発生や血管形成等に関連・機能性を有するRNAの発現量が増加していたことから、癌細胞と共培養することで、新生血管の発生・分化が促進されることが示唆された。
また、当初予定していた実験については、NSCLC患者の手術検体から分離したCAFにTet-On不死化ベクターを導入する方法を確立した。CAFと不死化CAFについて蛋白質の発現差異がないことを検証するため、二次元電気泳動、およびα-SMA、FAP、S100A4、Meflin蛋白質などの発現についてフローサイトメトリー解析を実施した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
2024年度の研究再開以降は、NSCLC患者の手術検体から発現制御可能Tet-On不死化CAFを作製し、Dox添加培地でTet-On不死化CAFを大量に増殖させた後に、培地からDoxを排除して10日ほど培養した不死化OFFのCAFを用いてRNA-sequencingによる網羅的解析を実施して、2023年度に実施したM-iPS細胞由来血管内皮細胞のRNA-sequencing解析結果と比較する。不死化OFFのCAFを用いた網羅的解析結果から、既にCAFで検出されることが報告されているタンパク質（α-SMAなど）と合わせてCAF候補マーカーの遺伝子／タンパク質を選出する。
また、二次元／三次元培養におけるNSCLC細胞の増殖・浸潤に対するCAFの役割とCAFマーカーの発現変化によるNSCLC細胞の増殖・浸潤への影響、さらにM-iPS細胞から分化したリンパ球と共培養した際のNSCLC細胞のviabilityに関するCAFの影響を検証する。具体的には選出されたCAFマーカーに関する遺伝子発現を、siRNAによる発現低下やCRISPR-Cas9を用いたゲノム編集により遺伝子ノックアウト、または遺伝子導入による強制発現細胞を作製し、CAF自身の増殖性や形態変化の検討とともに、NSCLC細胞との三次元ゲル培養を行い、CAFマーカーの発現ダウン／アップによる癌細胞の増殖・浸潤への影響を検討する。さらに患者のM-iPS細胞からNK細胞およびCTLを分化誘導して、二次元で共培養されたNSCLC細胞とCAF、またはNSCLC細胞とCAFによる三次元浮遊細胞凝集体の培地に添加し、培養上清を用いたELISA法や細胞凝集体の切片標本の免疫組織染色法などによる癌細胞のviabilityや反応を検証する。
|
| Causes of Carryover |
2023年度の年度途中より、産前産後・育児休暇を取得し、実施予定していた実験を全て実施することができず、物品購入および学会発表などを一時的に中断したため次年度使用額が生じた。
2024年度の研究再開後は、中断前に実施することができなかった検討を順次実施するが、復帰後に「産前産後の休暇、育児休業の取得又は海外における研究滞在等に伴う科学研究費助成事業（学術研究助成基金助成金）補助事業期間延長承認申請書（様式Ｆ－１３－２）」を提出予定であり、2023年度の繰越し分をを2024年度に使用し、2024年度の請求分を2025年度に使用予定とする。
具体的には、2024年度に、NSCLC患者の不死化OFFのCAFを用いた網羅的解析を行い、解析結果から、既にCAFで検出されることが報告されているタンパク質（α-SMAなど）と合わせてCAF候補マーカーの遺伝子／タンパク質を選出する。2025年度に、二次元／三次元培養におけるNSCLC細胞の増殖・浸潤に対するCAFの役割とCAFマーカーの発現変化によるNSCLC細胞の増殖・浸潤への影響、さらにM-iPS細胞から分化したリンパ球と共培養した際のNSCLC細胞のviabilityに関するCAFの影響を検証予定として、それに伴い消耗品の購入などを実施予定である。
|
