2023 Fiscal Year Research-status Report
Development of a method to specifically kill multidrug-resistant bacteria that produce sex pili
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22K08592
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| Research Institution | Nakamura Gakuen College |
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Principal Investigator |
川野 光興 中村学園大学, 栄養科学部, 准教授 (00455338)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鹿山 鎭男 国立感染症研究所, 薬剤耐性研究センター, 室長 (50432761)
近藤 恒平 国立感染症研究所, 薬剤耐性研究センター, 研究員 (60896554)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | バクテリオファージ / 薬剤耐性菌 / 抗菌法 / ファージセラピー / アンチセンスRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
小売店で購入した鶏肉から12種類のESBL産生菌を分離した。このESBL産生菌に感染し溶菌するファージの探索を行い、それを用いて食品上で殺菌効果の検証を行った。
下水サンプル液とESBL産生菌培養液を混合し、二重平板法を用いてプラーク形成実験を行った。上記実験において、プラークが大きかった3種類のファージ（φ13-1、φ14-1、φ17-1）を12種類のESBL産生菌に感染させる実験を二重平板法で行った。今回はMOI 100～0.0001の7種類とファージなしの合計8種類の条件にてマイクロタイタープレートを用いて実験を行った。30分おきに24時間継続してOD610の吸光度測定を行い増殖曲線を作成した。食品として鶏むね肉、プロセスチーズ、米飯を用い、紫外線で食品表面の細菌を殺菌しチューブに移した食品に宿主菌を塗布し、ファージ液を添加した。28℃で一晩培養した食品をSMバッファーで処理し、希釈した菌液をセフォタキシム含有LB寒天培地に塗布して37℃で一晩培養した。
12種類中10種類のESBL産生菌に対し感染するファージを単離することができた 。どのファージも探索に用いたESBL産生菌にしか感染せず、高い宿主特異性を示した。12種類中φ13-1のプラークが大きく透明度も高かったため、φ13-1の高力価ファージ液を作成した。液体培養におけるファージの感染実験において、24時間後に低い濁度を示したのは、MOI=1とMOI=0.01であった。チーズ上では、ファージを入れた液は6.0×10^5 cfu/mlを示し、ファージを入れていない液は2.3×10^7 cfu/mlを示し、ESBL産生菌を97.3%減少することができた。鶏肉と米飯ではファージによる殺菌効果を証明するには至らなかった。電子顕微鏡での撮影により、MyovirusとSiphovirusと呼ばれるファージを観察した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
前学期は授業と学生実験の授業がほぼ毎日あったため実験が思うように進まなかった。また、N型性線毛を感染の受容体とするファージを探索するための、ファージスクリーニングに用いる宿主菌の作製に予想よりも時間がかかった。ゲノム配列解読と情報解析を共同研究先に依頼しているが、解析依頼が多く未だ結果を得られていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度は、各種性線毛産生菌に特異的に感染するファージの探索を精力的に行っていく。ファージ取得後は、ゲノム解析、感染実験、性状解析、形態解析等を行う。ファージセラピーに向けて有用なファージが見つかった場合は、アンチセンスRNA遺伝子カセットの挿入や育種（変異）により、知財権を取得することのできる改変ファージの作成を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
1名の研究分担者分（10万円：5万円×2年度分）が未だ執行されていない。研究代表者も5千円弱の繰越額が生じたが、最終年度は消耗品等の購入で全額使用する。
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