Biosynthesis of bet-alanine in autolysosomes.

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K08681
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 上野 隆 順天堂大学, 大学院医学研究科, 客員教授 (10053373)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: ピリミジン分解 / ジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼ / ウレイドプロピオナ－ゼ / β－アラニン / オートファジー / オートリソソーム

Outline of Annual Research Achievements

タンパク分解に由来しないアミノ酸であるβ－アラニンが肝臓のリソソームに多く貯留するメカニズムを明らかにするのが研究目的である。β－アラニンはウラシルから2段階の酵素反応（ジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼおよびβウレイドプロピオナ－ゼ）で、それぞれジヒドロウラシル、ウレイドプロピオン酸（UPA）を経て生成する。先行する基盤研究C（課題番号18K08528）では、主として培養細胞を用いて前駆体であるウラシルやUPAを培地に加えてβ－アラニンの生成が増大するか、またβ－アラニンがリソソームに取り込まれるかの解析を試みた。しかし、そもそも48時間までの培養で細胞のβ－アラニンは高々20%程度が増える程度でコントロールと有意差も認められなかった。また、14C－β－アラニンを用いたリソソームへの輸送反応も今のところ捉えられていない。リソソームへのβ－アラニン輸送を調べる過程で、ジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼとβウレイドプロピオナ－ゼは選択的オートファジー基質としてオートリソソームに取り込まれることを見出した。そこで本基盤研究ではオートリソソームに取り込まれたβ－アラニン生成酵素によってβ－アラニンが生成し、結果的に（オート）リソソームに貯留するという仮説の基に研究を開始した。研究初年度ではオートファジーを活性化させた条件下で培養細胞のβ－アラニンレベルが上昇し、逆にオートファジーを阻害する条件下では減少するかに焦点を絞って解析を試みた。まずβ－アラニンをより感度良く定量する方法としてcapillary-electrophoresis mass spectrometry（CE-MS）を導入し、まずウラシル、UPA、β－アラニンを分別検出する条件を確立した。次にオートファジーを誘導する条件や阻害する条件で細胞全体のβ－アラニンが変動するかを調べたが、今のところ上記仮説は支持されていない

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

CE-MSによる高感度β－アラニン定量法が確立できたので、細胞全体レベルでのβ－アラニン量の検出に固執せず、単離したオートリソソームやリソソームを用いてウラシルやUPAからβ－アラニンの生成が起こるかどうかを集中的に調べる方向に転換しつつある。これまで、BRL、HepG2、Huh7などの肝臓由来培養細胞系で解析を進めてきたが、最終的な結論を得るためにはマウス肝臓から単離したオートリソソームを用いた実験を進めることが肝要と考える。そのために研究機関で大容量試料を扱うことが出来る新しい大型超遠心機を購入した。

Strategy for Future Research Activity

ピリミジン分解系は教科書的によく知られた代謝系であり、ウラシルからUPAを経てβ－アラニンが生成する過程は培養細胞レベルで確実に捉えることができると考えてきただけに、本研究初年度の解析でこの代謝反応の再現がうまく出来ないことは予想外であった。理由の一つとして、代謝系が肝臓を対象に調べられてきた上に、数日というような時間過程を要する緩慢な反応であることが考えられる。本研究課題の傍ら、BRL細胞を用いて細胞外からアイソトープ標識したβ－アラニンを取り込む反応の解析を進めている。すでに報告されているように、グリシンやアラニンなどのアミノ酸と競合する輸送系の働きで効率よくβ－アラニンが輸送されることを確認している。次のステップとして細胞外から取り込まれたβ－アラニンがリソソームへ輸送される可能性についても調べる必要がある。

Causes of Carryover

研究課題遂行に必須なマウスを使う実験が予定より遅れて培養細胞を用いた実験に特化したため、支出が予定より少なかった。