オルガノイドを用いたメチル基転移酵素による肝内胆管癌リンパ節転移の機序解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K08900
• Research Institution: Wakayama Medical University
• Principal Investigator: 速水 晋也 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (00468290)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上野 昌樹 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (90405465) ; 宮本 篤 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (00756570) ; 山上 裕機 和歌山県立医科大学, 医学部, 学長特命教員(特別顧問) (20191190)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 肝内胆管癌 / SMYD2 / メチル化 / オルガノイド / CRISPR/Cas9

Outline of Annual Research Achievements

i) 胆管癌オルガノイドの樹立
がんオルガノイド「F-PDO」の胆管癌由来RBIL001-2 (F_PDO_000012) を用いて、F-PDOプロトコールに則り、専用の培養液Cancer Cell Expansion Media plus（032-25745, 富士フイルム和光純薬）にて継代、3D立体構造を確認した。
ii) オルガノイドSMYD2発現解析－免疫化学染色
樹立培養したRBIL001-2におけるSMYD2発現解析として免疫化学染色を行った。抗SMYD2抗体（mouse monoclonal, sc-393827; Santa Cruz Biotechnology）および二次抗体Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594; ab150116, abcam)を使用、当大学に設置されている 共焦点レーザー走査型顕微鏡（ZEISS Confocal Laser Scanning Microscope Model LSM780）にて観察した。
iii) SMYD2抑制系実験システムの構築：CRISPR/Cas9によるSMYD2抑制系の構築
オルガノイドにおけるSMYD2抑制系として、CRISPR/Cas9遺伝子改変技術を使用した。Manufacturers’ protocolに則り、Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific)によるリポフェクタミン法でSMYD2 CRISPRプラスミド(h)（sc-403129; Santa Cruz Biotechnology）を導入した。免疫化学染色にてSMYD2の蛍光低下ないし消失を確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定・計画通り研究を遂行できている。

Strategy for Future Research Activity

当初の計画書通り研究を進める。

Causes of Carryover

4,285円の端数的な残高が生じ、次年度に繰り越して実験などに使用する。