2022 Fiscal Year Research-status Report
肺がんにおける癌関連線維芽細胞の機能解析と新規治療戦略の提案
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22K09000
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
磯野 友美 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (00869282)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
新谷 康 大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (90572983)
福井 絵里子 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (90814591)
狩野 孝 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (70528455)
大瀬 尚子 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (10570559)
舟木 壮一郎 大阪大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (50464251)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 癌関連線維芽細胞 / 肺癌 / 微小環境 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト肺癌中の癌関連繊維芽細胞（CAF）の機能解析のため、まずサブグループ解析、単離を目指した。前者には50,000個,後者には100,000個のCAF細胞が必要である。2021年10月ごろ、当時のプロトコルでは肺がんの腫瘍検体を分散して得られた140,000個以上の細胞中、ほとんどがリンパ球と腫瘍細胞で、CAFは100個未満で不足であった。回収細胞数の増大のため、細胞分散の条件検討を行った。物理的条件、酵素条件を探索的に検討した。結果、現時点で、分散した細胞中2-10%程度のCAFの分画を得られており、サブグループ解析に必要な数のCAFの検出は達成できるようになった。
併行して、フローサイトメトリー(FCM)のパネルの最適化のため、クローンの条件検討を行った。channelの節約のため、damp channelにCD45,CD31,EpCAMにまとめる必要があったため、この３つは特に分離が良いクローンの選択が必要であった。結果、それぞれに最適解が得られ、damp channelは完成した。CAFに特異的なマーカーでは、FAP,CD90,PDGFRβはクローンを決定した。しかし、αSMAは分離が不十分で検討の余地を残している。
2023年1月以降は、CAFの分画をサブグループ解析するため、damp channel(CD31,CD45, EpCAM)で除外後FAP,CD90,PDGFRβの３つのCAF特異的マーカーで染色し、SPADE, tSNE などの次元削減でサブグループの特定を数回試みた。結果、現行の３つのマーカーだけでは再現性が小さいことがわかった。現在、さらに４つのマーカーの追加によるとデータの蓄積、細胞の凍結保存を行っている。パネル最適化後、単離、機能解析を予定している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
細胞分散の条件検討に難渋し、半年程度で終了すると予想していたが１年を費やした。しかし、サブグループ解析には耐えられる程度のCAFが検出できるようになり、damp channelの構築が完了するなど実験は着実に進んでいると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞数の不足に対しては、得られるときに大量に凍結保存して、後日技術が確定してからの解析を予定した。これが得られなかったときは、増幅培養を検討する。パネルの複雑化に対しては専門家の協力を得る。サブグループ解析の方策が最適化したら、単離、ウエスタンブロットあるいはscRNAなどによる機能解析を進めていく。
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| Causes of Carryover |
本年度中に単離、機能解析まで進める予定であったが、条件検討を想定より多く行ったため、共同研の機器利用は単価が安い機器のみとなった。しかし、来年度以降は単離を行える上位機種の使用、抗体の大量消費が想定されるため、来年度以降の使用を予定した。
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