機能的な構造を有する腎・尿路再生への選択的細胞抽出法を応用した基礎的研究

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K09481
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 中根 明宏 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70464568)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 大貴 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (00620931) ; 西尾 英紀 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (10621063) ; 林 祐太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40238134) ; 安井 孝周 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40326153) ; 丸山 哲史 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (50305546) ; 水野 健太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70448710)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 再生医療 / 腎 / ES細胞

Outline of Annual Research Achievements

遺伝子導入ES細胞であるPax2 ES細胞を、Glasgow MEMにFCS、2-メルカプトエタノール、non-essential aminoacid、sodium pyruvate、LIFを加えたもので培養し、次にPax2 ES細胞をhanging drop法を用いembryoid body (EB)を形成させた。5日後にEBを再度ディッシュ上で数日間分化を進めて細胞塊を回収した。さらに5、10日目でEBを回収した。EBの遺伝子発現の確認をするため、ディッシュに平面培養したES細胞およびEBを0.25%トリプシンEDTA溶液にて回収し、mRNAを抽出、2-プロパノール、エタノールにて沈殿させ回収した。回収したEBに目的の遺伝子が発現しているかどうかをRT-PCR法を行った。回収したEBはRT-PCR法でPax2遺伝子が発現していることが確認できた。また他の腎発生の各段階で発現 して くる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認したところ、aquaporin-1、Integrin a8、BMP4、BMP7、Pax8、Podocinの発現上昇が認められた。そこ で、これらのEBをPax2発現細胞に対し、Pax2で標識した細胞を回収する条件でFACSを行い、細胞回収を行った。これらの細胞に対し、再度上記の遺伝子の発現が 上昇しているかをRT-PCR法で確認したところ、aquaporin-1の上昇が確認できた。今後他の培養条件を試し、違う性質の細胞が回収できるかを繰り返しながら、こ標的の細胞への分化が起こっているかの確認を継続する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

初期段階の細胞分化の確認はできたものの、他の培養条件での遺伝子発現が確認できていないため。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、追加された知見を取り入れながら、培養条件決定を継続する。

Causes of Carryover

本研究では、1) ES細胞を腎および尿路前駆細胞の至適分化条件で培養する。2) 培養各段階での胚様体(EB)での発現遺伝子を確認する。3)遺伝子発現が整った状態のEBの各段階で細胞を分けてセルソーティングで必要な細胞を回収し、3次元培養する。4)セルソーティングした細胞を免疫不全・腎不全マウスに移植し、腎再生医療へ応用できる実験系を確立するという4段階で研究を計画していた。第1、2段階を行い、尿細管細胞の分化を目指した目的の遺伝子の一部であるaquaporin-1の上昇が確認できた。計画自体は順調な滑り出しであったがCOVID-19による通常の医療業務が大幅に変更となり、予定してていた研究を進めることができなかった。また国際・国内学会出張も計画していたが、出張することもできなかった。このため次年度使用が生じた。