2023 Fiscal Year Research-status Report
内耳細胞死由来エクソソーム・DAMPsが海馬の空間情報処理に及ぼす影響の解明
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22K09674
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
林 賢 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 共同研究員 (80534528)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高島 明彦 学習院大学, 理学部, 教授 (00154774) [Withdrawn]
神崎 晶 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), その他部局等, 室長 (50286556)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | NaAsO2 / Nucleophagy / cGAS-STING / LaminB1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
時空間認識能・記憶に直接的に影響する脳内炎症の発症には、老化細胞の蓄積と慢性炎症が深く関与することが明らかになってきた。内耳培養細胞HEI-OC1を酸化ストレス誘導剤NaAsO2で曝露し実験を行った。NaAsO2曝露内耳細胞において、細胞増殖率は抑制されるが、死細胞数は増加しない条件（NaAsO2 0-72h, 250-500μM）を内耳細胞老化モデルの処理条件として、核内γH2AXフォーカス形成の有意な増加、SA-βgal陽性細胞数の有意な増加、SASP関連遺伝子の有意な発現上昇といった複数の老化表現型を確認し、NaAsO2曝露による酸化ストレス誘導性内耳細胞老化モデルを確立した。NaAsO2曝露内耳細胞の核周囲にLAMP1陽性のDNA断片を認めた。この結果は、核周囲に漏出したクロマチン断片に対して、nucleophagyによる細胞内クロマチン断片の細胞内消化が不十分な状態であることを示している。透過型電子顕微鏡下のNaAsO2暴露24h後の内耳細胞において、核膜の穿孔と、クロマチン断片漏出、エンドソーム、未熟なオートファゴソームの核周囲への集積を認めた。Lamin B1陽性のAggregates, BudsタイプとLamin B1陰性のSpecklesタイプを核周囲に認めた。一方、Lamin B1の核分画は、時間依存性に発現低下を認めた。この結果は、NaAsO2曝露内耳老化細胞において、核膜が損傷し、クロマチンが漏出している可能性を示唆している。Western blotによるタンパク質レベルでの発現解析において、cGASは発現増加したが、逆にSTINGは発現低下した。NaAsO2曝露によるLaminB1の発現低下と細胞質内に漏出するクロマチン断片によるcGAS活性化は、内耳細胞老化とSASPの誘導に深く関与する可能性を示唆している
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
HEI-OC1細胞は、温度感受性細胞であり、癌細胞や線維芽細胞とは異なり、やや培養の安定管理が難しく、生存率や増殖率の安定に時間を要し、研究結果が安定するまで時間を要したことが最大要因である。
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| Strategy for Future Research Activity |
亜ヒ酸ナトリウム（NaAsO2）曝露HEI-OC1細胞とコントロール細胞の培養液から分離抽出したエクソソームを、理研ジェネシスの受託サービスによるexo-miRNAの発現解析を行い、亜ヒ酸ナトリウム（NaAsO2）曝露による酸化ストレス誘導性内耳細胞老化に重要な役割を果たすexo-miRNAのプロファイリングを行う。cGAS KO細胞とLaminB1 KO 細胞を作製し、cGAS とLaminB1が分解型・分泌型nuclear autophagy (Nucleophagy)の誘導と内耳細胞老化に与える影響について検討する。さらに、処理細胞の培養液をELISA法によって細胞老化分泌形質（SASP）の発現解析を行う。プロファイリングした exo-miRNAから分解型・分泌型nuclear autophagy (Nucleophagy)の誘導と内耳細胞老化に関与するmiRNAを選定し、海馬神経初代培養細胞とミクログリア培養細胞に付加する。透過型電子顕微鏡下(TEM)にて、エクソソソーム表面マーカーCD81 の金コロイド染色を行い、エクソソソームが、海馬神経細胞とミクログリアに取り込まれるか否かを確認する。オートファジープローブ (Kaizuka T, Molecular Cell, 2016)を海馬神経培養細胞に導入し、オートファジー 分解能と細胞老化誘導の関係を評価する。分解型・分泌型nucleophagy解析を行う。新規 DAMPs を探索する目的にて、酸化ストレス・小胞体ストレス暴露細胞の RNA シー クエンス解析(理研ジェネシス)を行い、ダイイング・エイジングメッセージ遺伝子発現解析を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
前述したように培養細胞の培養が安定しなかったため、内耳細胞老化モデルの培養液から細胞外小胞を分離抽出し、記憶・時空間認識低下のドライーバーexo-miRNAの検索が、昨年までには終了しなかった。次年度使用が研究費使用計画は、前述した研究推進方策に基づき、RNA シークエンス、exo-miRNAのプロファイリングの受託サービス使用、ミクログリア培養細胞の購入、オートファジーを中心とした神経細胞死・細胞老化シグナル解析を蛋白質レベルで行うためにwestern blot用の抗体、消耗品の購入、グリア瘢痕形成の分子シグナル解析用の免疫染色用抗体と、その他消耗品の購入、tRNA抽出用キット購入、RNAseqによる解析に使用する予定である。
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