p53の機能獲得変異は口腔扁平上皮癌の治療標的となり得るか

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K10177
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 松田 亜沙実 札幌医科大学, 医療人育成センター, 研究員 (30897533)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐々木 泰史 札幌医科大学, 医療人育成センター, 教授 (70322328) ; 荻 和弘 札幌医科大学, 医学部, 講師 (40433114)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: p53 / 機能獲得変異 / 口腔扁平上皮癌 / トランスクリプトーム

Outline of Annual Research Achievements

本研究では，癌抑制遺伝子TP53の変異を高頻度に認める口腔扁平上皮癌に着目し，TP53機能獲得変異によって起こるトランスクリプトームの変動を分析し，機能解析へと展開する．さらに発現異常，遺伝子変異の有無，悪性度および治療効果との関連性を解析することで，p53ネットワーク破綻のメカニズムを標的とした口腔扁平上皮癌の治療法開発の基盤形成を目指す．本研究の目的は，口腔扁平上皮癌をモデルとして，変異型p53のGOF（gain-of-function）によって変化するトランスクリプトームの全貌を解明し，p53ネットワークのさらなる理解につなげることである．変異型p53を標的とした治療法の開発につながる基礎研究を目指している．TP53のGOF変異は，がん遺伝子の活性化変異と類似の作用を示すことが予想され，新しい分子標的の同定に進展する可能性がある．

本年度は以下の研究成果をあげた。
１）種々の細胞株に野生型，および3種の変異型p53（R175H, R249S, R273C）をアデノウイルスベクターを用いて導入し，非コードRNAに重点をおいたトランスクリプトーム解析を試みた．同定したトランスクリプトについては，qRT-PCRにより発現変化の再現性を順次確認し，変異型p53に発現変化する12の非コードRNAを同定した．
２）食道扁平上皮癌関連疾患である頭頚部扁平上皮癌26症例を対象に治療前後のctDNAの分析が治療効果と再発モニタリングに有用かを評価した。根治的治療後にctDNAが陰性化しない、または陰性化後早期に陽転化した症例全例で再発を認め、ctDNAが頭頚部扁平上皮癌の有望なバイオマーカーであることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1）次世代シークエンサー解析、およびp53結合コンセンサス配列の全ゲノム網羅的解析から、野生型、および変異型p53に制御されるタンパクコード遺伝子、非コードRNA、miRNAを複数同定している。

2）今年度は新規口腔扁平上皮癌症例29例のDNA, RNAの抽出を行い、p53，およびがん関連遺伝子の変異を解析した。その結果、20/29(69.0%)でp53変異を認めた。19のミスセンス変異を認め、今後GOF変異かどうかの検証を行う予定である。

3）GOF活性を評価した変異型p53発現プラスミド、またはアデノウイルスベクターを細胞株に導入し、細胞増殖能、抗がん剤感受性の解析を進めている。

Strategy for Future Research Activity

本研究では野生型・変異型p53によって制御されるトランスクリプトームを網羅的，かつ効率的に同定し，がんの発症・進展における役割を分析することで，p53ネットワークによる腫瘍抑制メカニズムのさらなる理解を目指す．

今年度は同定された変異型p53標的候補となるトランスクリプトームのうち、マイクロプロテインについて特に着目する．上記ゲノムレベルに加え，ペプチド抗体の作成，および質量分析等でタンパク質レベルでの解析を行う．また発現ベクターの導入による浸潤能，遊走能，増殖能などに与える影響，種々の分子生物学的手法を用いた転写・翻訳調節機構の解析を行う．さらに公共のデータベース（RefExA，GEO, cBioPortalなど）の活用，文献情報，モチーフ検索などを行い，増殖，細胞死，細胞分化などの機能的な面から，腫瘍の進展に関与することが予想される分子を絞り込む．また，臨床病理学的因子や治療反応性との相関を分析することで，臨床的な意義を見いだしていく．

Causes of Carryover

本年度は癌症例のRNA-seq(タンパクコード遺伝子・lincRNA)，small RNA-seq(miRNA)の解析(細胞株のランスクリプトーム)を行ったが、大学予算の試薬を使用できたため、充分な実験データが得られた。前年度の残額を含め最終的に70万円あまりの次年度使用額が生じた。
<使用計画> 施行済みの次世代シークエンサー解析、およびp53結合コンセンサス配列の全ゲノム網羅的解析から、p53に制御される非コードRNAの候補を同定している。成果の一部を学術誌に投稿し、revisionの判定がなされた。再投稿に必要な追加実験を予定している。新規症例の解析とともに、研究を他の癌に拡げることを計画しており、食道扁平上皮癌での共同研究を進めたい。細胞レベルでの発現・転写解析のための試薬類(次世代シークエンス試薬約180万円)、臨床検体でのRNA発現解析のための試薬類(酵素類約30万円)

Research Products

• [Journal Article] Serum soluble Fas levels and incidence of liver cancer in nested case-control study. (2023)
  • Author(s): Adachi Y, Nojima M, Mori M, Kubo T, Akutsu N, Sasaki Y, Nakase H, Lin Y, Kurozawa Y, Wakai K, Tamakoshi A
  • Journal Title: Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. Volume: - Pages: -
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Individualized circulating tumor DNA monitoring in head and neck squamous cell carcinoma. (2022)
  • Author(s): Kogo R, Manako T, Iwaya T, Nishizuka S, Hiraki H, Sasaki Y, Idogawa M, Tokino T, Koide A, Komune N, Yasumatsu R, Nakagawa T.
  • Journal Title: Cancer Med. Volume: 11 Pages: 3960-3968
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genomic analysis of an aggressive case with metastatic intrahepatic mucinous cholangiocarcinoma. (2022)
  • Author(s): Masaki Y, Akutsu N, Adachi Y, Ishigami K, Iwata N, Endo T, Ishii Y, Sasaki Y, Nagayama M, Kimura Y, Nakase H.
  • Journal Title: Clin J Gastroenterol. Volume: 15 Pages: 809-817
  • Peer Reviewed