2023 Fiscal Year Research-status Report

炎症性マクロファージのiNOS制御による動脈硬化進展抑制および再生血管変性予防

Research Project

Project/Area Number	22K11711
Research Institution	Juntendo University
Principal Investigator	加藤洋一順天堂大学, 医学部, 教授 (00231259)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	橋本良太順天堂大学, 医学部, 准教授 (60433786)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	マクロファージ / サイトカイン / LPS / マイトジェン活性化プロテインキナーゼ / JAK-STATシグナル / Toll様受容体 / IL-12
Outline of Annual Research Achievements	我々は、マクロファージを活性化するグラム陰性菌の外膜構成成分リポ多糖 (LPS) がSTAT-1を活性化するだけでなく、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK) をも活性化する (Hashimoto, Katoh et al.,2020) ことを報告した。その際にMAPKシグナル経路がJAK-STATシグナル経路に先んじて活性化されること、LPS単独刺激時よりもMAPKシグナル経路の阻害下でLPS刺激する方がJAK-STATシグナル経路の活性化、iNOS発現量およびNOガス産生量が増大することを突き止めた。サイトカインアレイを用いて、MAPKシグナル経路阻害下でのLPS刺激時に分泌が増大し、JAK-STATシグナル経路阻害下でのLPS刺激時に分泌が変化しないサイトカインを探索したところ、IL-12が浮上した。マクロファージにおいて、IL-12単独刺激はJAK-STATシグナル経路活性、iNOS発現量およびNOガス産生量に影響しなかったが、LPS刺激下でのIL-12はJAK-STATシグナル経路を活性化、iNOS発現量およびNOガス産生量を有意に増大した。ウイルスRNAを模倣する合成二本鎖RNAアナログのPoly I:C刺激下でも、IL-12はJAK-STATシグナル経路を活性化、iNOS発現量およびNOガス産生量を増大した。一方、抗IL-12中和抗体はLPS刺激によるJAK-STATシグナル経路の活性化とiNOS発現を有意に抑制し、マウス腹腔内へのLPS投与時の死亡率を有意に抑制した (in vivo)。以上より、LPSやPoly I:CなどのToll様受容体(TLR)アゴニストの存在下において、IL-12はiNOS発現量およびNOガス産生量を増大させる新たなサイトカインであることが示された（Cell Death Discov. 2023;9(1):374.）。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 「iNOS発現とNO産生、細胞傷害性に対するIL-12の影響の解明（in vitro）」に関しては、上記「研究実績の概要」でも述べた如く、ほぼ順調に進展した。マウスの大腿骨および脛骨から単離した骨髄由来マクロファージを用いて、IL-12負荷条件によるサイトカイン（IL-6、IL-12、TNF-alpha、IFN-gammaなど）の産生、iNOS発現とNO産生および細胞傷害性を検証した。サイトカイン産生はELISA法、iNOS発現はウェスタンブロッティング法、NO産生は2,3-ジアミノナフタレン（DAN）を利用した蛍光法、細胞障害性は死細胞の割合をPropidium Iodide（PI）染色後にフローサイトメトリーで測定を行った。各群5例ずつデータを取得して検討を加えた。 IL-12はJAK-STATシグナル経路を活性化、iNOS発現量およびNOガス産生量を増大する一方、抗IL-12中和抗体はLPS刺激によるJAK-STATシグナル経路の活性化とiNOS発現を有意に抑制し、マウス腹腔内へのLPS投与時の死亡率を有意に抑制した。ただし、検証 (ii) の「病原体感染模擬マウスおよび動脈硬化マウス（in vivo）におけるサイトカインおよびNO産生とIL-12抗体、経口LPSの影響をモニタリング」に関しては、特に動脈硬化モデルであるApoEノックアウト(KO)マウスにおいて、高脂肪食負荷４ヶ月後の胸部大動脈プラーク形成に縮小傾向はみられるものの、統計学的有意差を認めるには至っておらず、現在Nを増やして検討中である。
Strategy for Future Research Activity	動脈硬化マウス（in vivo）におけるサイトカインおよびNO産生とIL-12抗体、経口LPSの影響をモニタリングに関しては【現在までの進捗状況】で述べた如く、高脂肪食負荷４ヶ月後に、各種指標測定及び胸部大動脈プラーク形成を検討する。「ヒト由来マクロファージを用いた、iNOS発現とNO産生および細胞傷害性に対するIL-12の影響の解明（in vitro）」では、ヒト由来マクロファージを用いて、【研究実績の概要】で述べたのと同様のin vitro実験を行い、マウスとヒトにおける異同を検証する。購入したヒト単球をマクロファージに分化誘導させて使用する。この結果を、次期以降に行う「ヒトに応用するためのトランスレーショナルリサーチ」の予備データとする。各群5例ずつデータを取得する。引き続き、「IL-12の再生血管変性への関与を解明（in vitro, in vivo）」を行う。動脈圧に耐え得る再生血管の使用が、特に血液透析時のアクセス血管として想定されていることに鑑み、一昨年までの基盤研究により我々が確立した骨髄単核球由来再生血管を用いて、IL-12抗体がLPS暴露下での再生血管変性に与える影響について検討し、その耐久化につながる可能性につき検証する。
Causes of Carryover	【現在までの進捗状況】でも述べた如く、動脈硬化マウスを含めた消耗品についての支出がやや多くなったため、次年度使用額が生じた。ただし、その額は1,434円と大きくはなく、次年度の研究遂行に支障はないものと考える。