2023 Fiscal Year Research-status Report
アンジオテンシンによる脳血管老化機序の解明と認知症治療への展開
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22K11829
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
閔 莉娟 愛媛大学, 医学系研究科, 講師 (80726175)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 脳血管細胞 / 脳血管老化 / 認知機能 / アルツハイマー病 / AngII / シャペロン介在性オートファジー / LAMP-2A |
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| Outline of Annual Research Achievements |
[目的] ①アンジオテンシン（Ang）II刺激が脳血管細胞を老化させ、認知機能を低下させることを個体レベルで実証する。②AngIIが脳血管老化を促進するメカニズムをシャペロン介在性オートファジー（CMA）に着目して明らかにする。③AngII-CMA-脳血管老化-認知機能低下の関係を明らかにする。
[方法] マイクロ浸透圧ポンプでAngIIを脳室内投与したC57BL/6Jマウスからの脳血管とAngII連日刺激した脳血管平滑筋細胞（BVSMC）を用い、老化関連βガラクトシダーゼ(SA-β-gal)染色により脳血管細胞老化を評価した。老化関連因子p53やp16などCDKIの発現、CMA経路関係因子LAMP-2A、Hsc70、Hsp90、CHIPなどの発現はAngII連日刺激したBVSMCのライセ―トを用い、ウェスタンブロッティング法にて測定した。AT1受容体阻害剤ARBであるvalsartan、抗酸化剤であるSODの存在下で、AngII刺激によるLAMP-2Aなどの発現量を調べた。BVSMCにLAMP-2Aのプラスミドをトランスフェクションして、AngII刺激によりCDKIの発現と老化が抑制されるかを検討した。
[結果] AngIIの脳室内投与マウスの脳血管のSA-β-gal染色実験のデータは不安定なので、AngIIの脳室内への投与方法はまた改善している。AngIIで連日刺激によりBVSMCの老化細胞数とp53、p21、p27、p16などCDKIの発現は増加したことが認められた。また、BVSMCへのAngII刺激によりCMA経路関係因子の中、LAMP-2Aの発現は減少したことが認められた。こうした増加した老化関連マーカーや、減少したLAMP-2AはAT1受容体阻害剤ARBと抗酸化剤の添加により抑制された。LAMP-2AのプラスミドをトランスフェクションしたBVSMCでは、AngIIで誘導したBVSMCの老化細胞数とCDKI発現の増加は認められなかった。
[結論] AngIIがCDKIを介して脳血管細胞を老化させる可能性が示唆された。そのメカニズムにはCMA経路関係因子であるLAMP-2Aが深く関与している可能性も示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
一つの理由はマイクロ浸透圧ポンプでAngIIの脳室内への投与は不順調だった。カテーテル先端の針をしっかり固定できなかったので、十分量のAngIIが脳室内に流入したかを確定できなかった。もう一つの理由はLAMP-2Aのコンストラクトの作製は不順調だった。Midi Prepの時、技術の原因で、何回やってもプラスミドDNAの精製度は低かった。また、ストックしたBVSMCを解凍したら、増殖がよく悪くて、細胞の数が増えにくくなったため、よく新しい細胞を採取したことがあって、実験の時間を伸びた。以上の理由で、in vivoとin vitroの両方の実験を円滑に進まなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後以下の順に研究を推進する：
１．in vivoで、マイクロ浸透圧ポンプでAngIIの脳室内投与の実験技術を改善して、AngII投与マウスから脳血管を採取し、SA-β-gal染色で脳血管老化の評価を繰り返す。また、脳血管からタンパクを抽出し、老化関連因子p53やp16などCDKIの発現、CMA経路関係因子LAMP-2Aの発現をウェスタンブロッティング法で測定する。２．In vivoとin vitroを同時に進む。AngII投与したマウスの脳血管とAngII連日刺激したBVSMCを用い、酸化ストレス（DHE染色、NADPH oxidase活性）、ミトコンドリアDNA損傷（8-OHDG）を検討する。３．in vivoで、行動解析試験（バーンズ迷路、Y字迷路等）を実施しAngII投与したマウスの認知機能を評価し、脳内Aβレベル（ELISA及びウェスタンブロッティング法）、脳内炎症（real-time RT-PCRによる炎症因子のmRNA発現測定）、神経細胞障害（免疫染色法によるpyknosisやアポトーシス検出）の度合いを調べる。４． LAMP-2Aが含まれるCMA因子によるCDKIの分解が促進されるか否か明らかにするために、免疫蛍光染色、免疫沈降法、生化学的分画法などを組み合わせて、CDKIとHsp90/Hsc70、LAMP-2Aとの相互作用、およびリソソームへの移行を検討する。５．血管平滑筋特異的にLAMP-2Aの発現を増強させた遺伝子組換えマウスを作出し、上記の手法で、高発現のLAMP-2AがAngII誘導された脳血管老化を抑制し、Aβ蓄積や神経細胞障害を軽減させ、認知機能が改善されるか明らかにする。
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| Causes of Carryover |
次年度に必要な物品等を購入するために繰り越し
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