Does phase-separation of DNA double-strand break repair factors promote chromosome rearrangement?

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K12376
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 山内 基弘 九州大学, アイソトープ統合安全管理センター(馬出地区), 准教授 (60437910)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 尾崎 貴恵 九州大学, アイソトープ統合安全管理センター(馬出地区), 学術推進専門員 (80933548)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: DNA二本鎖切断 / DNA修復 / 染色体再編成 / 相分離

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、53BP1やその他のDNA二本鎖切断（DSB）修復因子の相分離と染色体再編成の関係を明らかにすることである。2022年度は、オンラインプログラムで天然変性領域を持つことが予測されたDSB修復関連因子が、細胞内のDSB部位で相分離するかどうかを調べた。DSB修復関連因子のDSB部位における集積は、正常ヒト網膜上皮細胞RPE-hTERT細胞にγ線を照射後固定して、それぞれのDSB修復関連因子に対する抗体を用いた蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡下で斑点状の「フォーカス」として可視化した。相分離阻害剤としては、1,6-ヘキサンジオールや酢酸アンモニウム、スクロースを用い、γ線照射30分前から固定時まで細胞に処理した。この実験の結果、DSB修復関連因子のうち、CtIP、BRCA1、RAD51AP1タンパク質が相分離阻害剤処理時にDSB部位にフォーカスを形成しなくなることがわかった。この結果はこれらのタンパク質のDSB部位への集積に相分離が必要であることを示唆する。さらにCtIPについては、GFP融合タンパク質を発現するベクターを作製して細胞に導入したところ、GFP-CtIPは相分離するタンパク質の特徴である、液滴形成を示した。この結果はCtIPタンパク質が相分離していることを示している。また53BP1に関しては、相分離に必要な領域を欠失した「相分離不能変異体」の発現ベクターを作製中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2022年度の主な計画は、相分離するDSB修復因子のスクリーニングであり、実際に細胞内で相分離するタンパク質を同定することができたため。

Strategy for Future Research Activity

2023年度は以下の方策で研究を推進していく予定である。
1.53BP1については、相分離不能変異体の発現ベクターを完成させ、細胞に導入し、染色体再編成の頻度を調べる。
2.CtIPについては、細胞内で相分離することをOptoDroplet法でも確認する。また天然変性領域の欠失変異体を作製し、相分離に最小限必要な領域を同定し、相分離不能変異体を作製する。
3.BRCA1、RAD51AP1についてもGFP融合タンパク質発現ベクターやOptoDropletベクターを作製し、細胞に導入後、液滴を形成するかどうかを調べる。液滴を形成する場合には、天然変性領域の欠失変異体を作製し、相分離に最小限必要な領域を同定し、相分離不能変異体を作製する。
4.オンラインプログラムで天然変性領域を持つことが予測されているものの、細胞内で相分離するかどうかをまだ調べていないDSB修復因子もあるので、それらの因子についても検討を行う。

Causes of Carryover

2022年度の直接経費のうち、78,679円を2023年度に繰り越した。これは、2022年度末に購入予定だった試薬（約79,000円）の改良バージョンが2023年度に発売されるとの情報を得たためである。繰り越した金額は、試薬の改良バージョンが発売され次第、執行する。