DNA修復蛋白質53BP1によるCD47クラスター形成とがん細胞貪食機構の解明

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K12381
• Research Institution: Kanazawa Medical University
• Principal Investigator: 砂谷 優実 金沢医科大学, 医学部, 講師 (70581057)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: アポトーシス

Outline of Annual Research Achievements

Don’t eat-me signal分子であるCD47は、細胞の表層に露出して食細胞表層の貪食阻害受容体SIRPalphaと結合することで貪食を防いでいる。一方、アポトーシス細胞の表層においては、CD47は脂質ラフト層でクラスターを形成してSIRPalphaと解離し、貪食によるアポトーシス細胞の排除を促すと考えられている。研究代表者はこれまでに、DNA修復タンパク質53BP1がカスパーゼの基質となりC末断片化すること、および53BP1を欠損したアポトーシス細胞ではCD47のクラスター形成が減少していることを見出した。本研究では、53BP1が、カスパーゼによるC末断片化を引き金としてCD47のクラスター形成を誘導することで、食細胞によるアポトーシス細胞の貪食除去を促すというモデルを立案した。このモデルを立証するため、CD47のクラスター形成およびアポトーシス細胞の貪食における53BP1C末断片化依存性の有無を検証し、53BP1C末断片に存在すると考えられる機能ドメインを明らかにしようと試みた。
R5年度は、候補となる機能ドメインの変異型53BP1C末断片安定発現細胞株全種類を樹立した。それらの細胞株を用いた解析により、CD47のクラスター形成が53BP1C末断片中のBRCTドメイン依存性の現象であることを明らかにした。さらにCD47のクラスター形成は、BRCTドメインに存在するリン酸化タンパク質結合責任アミノ酸残基を必要とすることを見出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1）R5年度に樹立が困難であったBRCTドメイン変異型53BP1C末断片安定発現細胞株の樹立に、別の手法を用いて再度取り組んだ。CRISPR/Cas9のゲノム編集によるノックイン技術を用いて、53BP1遺伝子座に存在するBRCTドメインの機能性アミノ酸残基（既に報告のある3つのアミノ酸残基）それぞれに対して塩基置換変異を導入することで、53BP1BRCTドメイン変異細胞株を樹立することを試みた。その結果、高頻度でゲノム編集が起こり、目的のBRCTドメイン変異細胞株3種類を複数クローン樹立することができた。
2）1）で樹立した細胞株、およびR4年度までに樹立していた野生型、5BP1欠損型、および53BP1C末断片安定発現細胞株各種を用いてアポトーシス細胞表層におけるCD47のクラスター形成に必要な機能ドメインを検索した。その結果、53BP1欠損により引き起こされるCD47のクラスター形成の減少は、53BP1C末断片安定発現株では回復したが、BRCTドメイン変異株のうちリン酸化タンパク質結合変異細胞株では回復しなかった。この結果から、アポトーシス細胞表層におけるCD47のクラスター形成は、53BP1C末断片に存在するBRCTドメインが持つリン酸化タンパク質結合活性依存性であることが示唆された。

Strategy for Future Research Activity

最終年度であるR6年度では、野生型、53BP1欠損型、53BP1C末断片発現細胞株およびヒトマクロファージ株を用いて、以下の3つの現象がアポトーシス細胞の53BP1C末断片に存在するBRCTドメイン内のリン酸化タンパク質結合活性依存性であるかを検証する。
1）CD47とSIRPalpha結合の解離
2）eat-me signal分子の細胞表層CD47領域外への露出
3）アポトーシス細胞貪食の誘導

Causes of Carryover

CD47とSIRPalphaの結合の検出方法にはproximity ligation assayを、eat-me signal分子の局在解析およびin vitro貪食の検出方法には蛍光免疫染色を計画しているが、いずれも実験データの取得と解析に多くの時間を要する。R6年度内の研究完了を目指すべく、研究補助員に支援を依頼することにし、そのための人件費を次年度に繰り越した。