2022 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
22K18365
|
|---|
| Research Institution | Nagoya University |
|---|
Principal Investigator |
田中 実 名古屋大学, 理学研究科, 教授 (80202175)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
|
| Keywords | 減数分裂 / 性差 / クロマチン動態 / メダカ / rec8 / terb1 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
申請者はメダカ生殖細胞の性決定研究においてメス特有の減数分裂機構が存在することを発見し(Science 2015, PNAS 2020)、染色体高次構造を作り出すコヒーシン（REC8）が関わることを見出した。メダカには２つのrec8 遺伝子（rec8a, rec8b）が存在し、rec8a変異体はメスでのみ減数分裂が停止することから、コヒーシンの量的あるいは質的な性差が染色体高次構造を変え、組換えランドスケープの性差をもたらすと考えた。
減数分裂の性差は、染色体あたりの組換えの数や位置（組換えランドスケープ）の差として認められ、その組換えランドスケープは以下に述べる減数分裂染色体の「高次構造」と「核内動態」を基盤として形成される。本研究ではこの高次構造と核内動態に着目して解析を行う。
本研究では、高輝度高解像度のライブイメージング手法と条件的タンパク質分解法を確立し、独自の変異体を用いた核内動態解析と超解像度顕微鏡による染色体構造解析を行い、組換えランドスケープの性差をもたらす分子機構を明らかにする。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
相同染色体軸を構成するタンパク質 SCYP3 と EGFP とを融合させた遺伝子をメダカの SCYP3 遺伝子の制御領域に組み込んだコンストラクトを作製し、メダカに導入してトランスジェニックメダカSYCP3_EGFP 系統を確立した。そこでSYCP3_EGFP 系統を用いて、減数分裂期の染色体動態の可視化を試みた。
この系統とスピニングディスク共焦点レーザー顕微鏡を用いて最終的に数分にわたる減数分裂前期相同染色体動態のイメージングに成功した。減数分裂前期は相同染色体の形成過程でレプトテンやザイゴテン、パキテンなどに分けられるが、以前のマウスの報告とは異なる時期、パキテン期にメダカの相同染色体は大きな回転運動を行うことが示された。
また AID を用いた特定タンパク質の誘導的分解がメダカの生殖細胞でも適応できるかの検討を行なった。AID をターゲットとした分解を媒介するTIR と、AID でタグ付した EGFP のRNA をメダカ受精卵にマイクロインジェクションし、分解誘導物質オーキシンアナログの存在、非存在下で生殖細胞でのEGFP蛍光強度を調べた。オーキシンアナログを加えた場合インジェクションRNAから翻訳されたEGFP蛍光は加えない時よりも明らかに減弱していた。
また組換えランドスケープを調べるために、組換えマーカーMLH1に対する抗体、雌雄の生殖細胞で発現の異なるRec8a/bに対する抗体の作製を行なった。Rec8a/bのそれぞれに対する特異抗体を得ることには成功した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
特定タンパク質をAIDにより誘導分解するシステムはメダカ でも可能との予備結果が得られたが、これはRNAから翻訳されたタンパク質での結果である。トランスジェニックメダカも用いて、de novo でタンパク質が発現した時の詳細なデータの取得を引き続き行う。
減数分裂前期の相同染色体動態の解析に成功し、他の動物では報告のない知見も得ることができた。今後はこの培養時間とイメージ取得時間を長くすることを試みる。パキテン以前の染色体動体がどうであるのかの解析も推し進める。そしてこの動きに性差があった場合、terb１や rec8 などのその他の減数分裂因子変異体によっても動態や組換えランドスケープの性差が影響を受けるのかを解析する。また組換えランドスケープを解析するための抗体作製をおこなう。
また動態とは別にrec8a/bなどの減数分裂因子変異体の相同染色体軸長や組換え位置や個数の性差を調べ、これらのどの要素が減数分裂生さと繋がるのかを明らかにしていく。
|
| Causes of Carryover |
複数回にわたる組換えランドスケープ解析では重要な要素である組換え位置を特定するマーカーを得ることができなかった。MLH1変異体も作製し、そのホモ接合体で表現型の解析を予備的に行なったが、マウスや他の動物での変異体表現型とは異なり、メダカのMLH1変異体で減数分裂生殖細胞に明らかな障害を認めることができなかった。このことはメダカMLH1は他の脊椎動物とは違う機能を有するのか、ほかのタンパク質がMLH1を補完して働いていることを示唆している。そこでMLH1以外でマーカーとなり得るタンパク質をターゲットとして抗体を作成することにした。このためこの抗体作製の経費と、詳細な組換えランドスケープ解析のための経費、さらにゲノムや転写物解析の経費を次年度に持ち越すこととした。
|
