2023 Fiscal Year Research-status Report
in-situビオチン化プロテオミクスによるタンパク質状態の定量化技術の開発
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22K19288
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
松本 雅記 新潟大学, 医歯学系, 教授 (60380531)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Keywords | プロテオミクス / タンパク質間相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では細胞内のタンパク質状態の網羅的計測技術の開発を目的とする。ほとんどのタンパク質は細胞内で他のタンパク質と相互作用したり、リン酸化などによってその構造状態を変化させたりしていると考えられる。例えば哺乳類細胞の有糸分裂期の細胞は、細胞核膜は消失や微小菅などの細胞骨格の再構成など極めて劇的な形態変化が認められるが、このような状況下では、細胞全体にわたってタンパク質の状態変化が生じていると思われる。しかしながら、その実態を迅速かつ網羅的に見る手段は存在しない。そこで、膜透過性ビオチン化試薬を用いたin situ ビオチン化プロテオミクスを確立し、既存の相互作用プロテオミクスの手法を適用した結果と比較することで、各ビオチン化部位の変化の構造的な意義付けを行い、迅速に細胞内タンパク質状態をモニターする技術の確立を試みる。
今年度は、非変性条件下でのサイズ排除クロマトグラフィーや密度勾配遠心法とdata-independent acquisition (DIA)法による高スループット高深度プロテオミクスを組み合わせることで、大規模なタンパク質相互作用マップの構築を実施した。データ解析法としては、既知の複合体上へ同定結果をマップするツールであるCCprofilerと新規複合体同定ツールであるPCProhetを利用して多数の複合体および新規相互作用を同定した。さらに、昨年度取得したin situ biotylation proteomicによるプロテオーム状態データとの比較を行なった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本研究では独自に考案したin situ biotinylation proteomic法の構築と、そのデータ解釈のための共溶出プロテオミクスによるタンパク質間相互作用マップの作成と照合が主要な開発内容である。共溶出プロテオミクスでは大量の質量分析測定を実施する必要があるが、本年度は約3ヶ月にわたる装置の不調によってデータ取得に遅れがあった。また、データ解析ツールは既存のオープンソースのソフトウェアを利用しているが、我々の環境でそのまま稼働させることができず、いくつかの修正を行う必要があり時間を要した。本研究が目指す技術基盤開発自体は滞りなくできたが、これを用いたデータ取得や解析に時間を要したため、結果の解釈や成果の取りまとめに遅れが生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで技術基盤の開発には特に問題がなかったが、データ解析や解釈をより正確に行うために新たな実験を実施する必要が出てきた。本研究では一回のデータセット取得に数百の測定を必要とするため質量分析計の安定運用が必要不可欠である。そのため、経年劣化による消耗の可能性があるパーツの交換やメーカーによるメンテナンスの頻度を上げることで大量データを安定に取得することに努める。また、データ解析には計算時間がかかるため、複数のサーバーで並列解析するなどの方策を立てる。
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| Causes of Carryover |
質量分析計および液体クロマトグラフィーの不具合に伴い、測定をできない時期が３ヶ月ほど発生した。また、データ解析ツールの現在の環境における適合が悪く解析が停滞した。これらの遅延に伴い、次年度に大量の測定を予定する必要が生じたため、必要なカラム等の消耗品や機器の消耗パーツを購入する予定としている。また、本研究の成果を発表するための旅費や論文掲載料なども次年度支出予定としている。
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