2023 Fiscal Year Research-status Report
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22K19306
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
川上 厚志 東京工業大学, 生命理工学院, 准教授 (00221896)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川口 茜 国立遺伝学研究所, ゲノム・進化研究系, 助教 (10749013)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Keywords | 組織再生 / ゼブラフィッシュ / ヒレ / 位置情報 / エピゲノム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多細胞体には位置情報が存在すると考えられるが，発生後の組織における存在は明らかでない。私達は，移植実験によって，魚類の鰭条に長さを指令する情報が内在性に存在し，鰭条毎の位置情報は長期に安定で繰り返し再生を行った場合でもほぼ変化しないこと，鰭条の長さ情報は基部―先端部に沿って一様に分布していることを初年度の研究で明らかにした。また，長い鰭条と短い鰭条の位置情報に従って発現が制御される制御因子の探索を試み，いくつかの鰭条毎に発現量が異なる，再生芽の増殖を制御すると考えられる遺伝子候補を同定した。
再生組織は切断面の再生芽の増殖によって再形成されることから，長さの情報は鰭条毎に発現量が異なるような再生芽の増殖因子であろうと考えられた。そこで，長い短い鰭条間で異なって増殖を制御すると予想された候補遺伝子の強制発現によるアプローチを試みた。RNAプロファイリングによって同定した，Inhibin/Tgfb/Bmpの阻害分子であるFolistatin-like遺伝子や，Wntリガンドの阻害分子であるDkk3を増殖制御因子について，熱誘導プロモーター下に発現するコンストラクトの作製とトランスジェニックゼブラフィッシュの作製を行い，強制発現したFollistatin-like, Dkk3の再生時のヒレ形態への効果を検証した。しかしながら，組織全体での強制発現では再生した長さへの明瞭な効果はこれまでのところ認められていない。
位置情報とは組織の部域による増殖制御であること，さらにそれは長期に安定で細胞に内在のものであることが見えてきた。このような増殖のチューニングには，増殖に関わるような遺伝子の，細胞系譜や部域によるエピジェネティックな制御が関わると考えられる。そこで，さらに位置情報メカニズムを解明するアプローチとして，ヒレの部域毎のゲノムワイドなエピジェネティック解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
多細胞体における位置情報のメカニズムについて，今年度においては以下の研究の進捗があった。
１．鰭条間で異なって増殖を制御すると予想された遺伝子の強制発現によるアプローチを試みた。長い短い鰭条の発現遺伝子レベルをRNAプロファイリングによって比較し，いくつかの候補遺伝子を同定した。
２．RNAプロファイリングによって同定したFolistatin-like遺伝子およびDkk3を，熱誘導プロモーター下に発現するコンストラクトの作製とトランスジェニックゼブラフィッシュの作製を行った。いくつかのトランスジェニック系統を作製し，これらを用いて強制発現したFollistatin-like, Dkk3の再生ヒレ形態への効果を検証した。トランスジェニックの作製には最低でも３世代の交配を要したが，それらの解析はほとんど差が認められず，予想よりも多くの時間を要した。おそらく，発現効率が内在のものを遥かに超えるほど多くなく，内在の遺伝子の領域差を埋めるほどではなかった可能性が考えられる。今後，一部の領域での発現を誘導するような方法が必要であろう。
３．これまでの解析から，位置情報とは組織の部域による増殖制御であること，さらにそれは長期に安定で細胞に内在のものであることが解明できた。このような増殖のチューニングには，増殖に関わるような遺伝子の，細胞系譜や部域によるエピジェネティックな制御が関わると考えられ，ヒレの部域毎のゲノムワイドなエピジェネティック解析を進めている。このために，エピジェネティック解析の専門家，川口茜博士らと共同研究を開始し，当初の予定よりはやや遅れたが，組織のサンプリング，RNA抽出等を完了したところである。
以上，計画の見直しもあり，進捗はやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
多細胞体における位置情報のメカニズム解明のため，今後は以下の研究を推進する予定である。
１．これまでの解析から，位置情報とは組織の部域による増殖制御であること，さらにそれは長期に安定で細胞に内在のものであることが解明でき，増殖に関わるような遺伝子の，細胞系譜や部域によるエピジェネティックな制御が位置情報の実体に関わると考えられた。そこで，ヒレの部域毎のゲノムワイドなエピジェネティック解析を進め，発現が部域によって異なる遺伝子，特に増殖制御に関わるものの周囲のエピゲノムの違いを同定する。
２．明らかになったゲノムDNA上の修飾の違いが発現差に結びついているか，遺伝学的な改変を行って検証する。また，それによって，ヒレの形態そのものも改変可能か検証する。
３．ヒレ鰭条の長さの違いは再生芽の増殖の程度によっているが，細胞の増殖速度に差があるのか，最初に再生芽にリクルートされてくるプライム化された細胞数に差があるのか，それらの両方なのかは明らかでない。そこで，Cre-loxPなどの細胞標識を用いて，再生芽へとリクルートされる間葉細胞の数と，それらの増殖速度，増殖率を計測することにより，位置情報の形態への翻訳機構を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
ゲノムワイドなクロマチンのエピゲノム解析を行うため，新たに共同研究者を追加して，研究計画の練り直し，打ち合わせを行った。これに予定していなかった時間がかかり，さらに，実験を行うための実験動物系統の繁殖をサンプル採取をナット年度末近くになって行うことができた。実際のクロマチン解析とインフォマティックス解析は2024年度に行うことになったため次年度使用が生じた。
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[Journal Article] Splashed E-box and AP-1 motifs cooperatively drive regeneration response and shape regeneration abilities.2023
Author(s)
Tamaki, T., Yoshida, T., Shibata, E., Nishihara, H., Ochi, H., and Kawakami，A.
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Journal Title
Biology Open
Volume: 12
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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