2022 Fiscal Year Research-status Report
生体脳での軸索起始部の観察と操作を可能にする技術基盤の確立
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22K19358
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
久場 博司 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (10362469)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2024-03-31
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| Keywords | 軸索 / ゲノム編集 / 可視化 / 操作 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
軸索起始部（AIS）可塑性は、脳の機能や病態を決定する上で中核的な役割を担うと考えられる。しかしながら、その回路・個体レベルでの意義に対する理解は進んでいない。この主な理由として、現在のAIS研究では同一細胞でのAIS分布の継時変化を評価することが困難なことが挙げられる。本研究では、生体脳においてAIS分布を連続的に観察する技術と人為的に操作するための技術基盤を確立する。
本年度はAIS局在分子標識によるAIS可視化ツールの構築を目指した。標識分子の過剰発現では分子がAIS外に逸脱し、AISのみの可視化は困難である。従って、ゲノム編集を用いたノックインによる内在性蛋白質標識（SLENDR法）を行うことで、AISに高密度で局在することが知られる電位依存性Naチャネル（Nav1.6）とその足場タンパク質（ankyrinG）の標識を試みた。具体的には、これら分子のC末にHA-tag配列を挿入するよう設計されたplasmidベクターを電気穿孔法によりニワトリ脳幹の聴覚神経細胞へ導入し、組織固定後に抗体染色を行うことでAISの可視化を行った。その結果、ankyrinGの標識ではAISが確認できたものの、導入効率が低く、かつNav1.6の信号は確認することができなかった。従って、さらにこれらの改善を試みた。まず、導入効率を高めるために、Cas9タンパク質とgRNAを試験管内で複合体形成させたものを電気穿孔法で導入する方法（eCHIKIN法）を試みたところ、導入細胞を大幅に増やすことができた。次に、信号強度を高めるために、挿入するHA-tagを従来の1つから4つに増やしたところ、信号強度が大幅に増強し、Nav1.6の信号を確認することができた。一方、HA-tagの増加による導入効率の低下は見られなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
SLENDR法を用いた分子標識によるAISの可視化において信号強度の向上に成功し、ライブでのAIS可視化への道筋が見えたため。またノックアウトスクリーニングの候補分子の選定も順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
HA-tagをHalo-tagに変更し、in vivoでのAISの可視化を試みる。Halo-tagによる標識には長いsingle strand DNAの合成が必要なため、PCRの条件検討を行う。Knock-outについては、U6プロモーターをchicken由来にし、guide RNAを3つ繋げることにより、ノックアウト効率を高めるとともに、RNA-seqにより選定した候補分子のノックアウトを行う。このことにより、AIS可塑性の操作に使用可能な分子の抽出を進める。さらに、これら候補の中からCALI法による光活性操作を行う分子を選定し、その効果を切片培養標本にて検証する。
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| Causes of Carryover |
固定標本における信号強度の評価を効率的に進めることができたため、動物と試薬の経費を節約することができた。次年度の生体標本での評価における動物と試薬のため経費として使用する。
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