2022 Fiscal Year Research-status Report

生細胞で二次メッセンジャー濃度を自由自在に制御する手法の開発と応用

Research Project

Project/Area Number	22K19401
Research Institution	The University of Electro-Communications
Principal Investigator	白川英樹電気通信大学, 大学院情報理工学研究科, 准教授 (40241070)
Project Period (FY)	2022-06-30 – 2025-03-31
Keywords	カルシウムシグナリング / 細胞内シグナル伝達 / オプトジェネティクス
Outline of Annual Research Achievements	光応答性イノシトール三リン酸（IP3）合成酵素作成のベースとなるタンパク質として、ホスホリパーゼＣゼータ（PLCz）の構造機能相関を精査した結果、これまで活性に必須であるとされていたEFドメインを除去してもIP3産生活性を維持できることを見出した。またＸとＹドメイン間のリンカー領域で切断した分割型PLCzも、共発現させると活性が回復することを確認した。しかし、分割型PLCzのそれぞれに青色光光受容タンパク質pMagとnMag、または赤色光受容タンパク質PhyBとその結合タンパク質PIIFを付加したものを共発現させた場合、青色光または赤色光を照射した際にIP3産生の有意な増加を示す細胞内Ca2+濃度上昇応答は確認されなかった。一方、IP3分解酵素であるIP3-5-ホスファターゼA（IPP5A）の細胞膜局在化配列を除去した変異体を作成したところ、野生型にくらべPLCｚによって誘発されるCa2+濃度上昇応答に対する抑制作用が強く、細胞内IP3分解効率が高いことが示唆されたため、この変異型IPP5Aを光応答性IP3分解酵素作成のベースとして用いることとした。蛍光性IP3センサーの改良については、蛍光タンパク質CFPとYFP、およびI型IP3受容体のIP3結合部位からなるFRET型のセンサータンパク質をベースに、各蛍光タンパク質の循環置換型変異体を用いたものや、IP3結合部位内またはIP3結合部位と蛍光タンパク質間のリンカー長の異なるものを作成したところ、IP3結合部位内に15アミノ酸を付加したものでFRETシグナルのIP3依存的変化率に若干の向上か見られた。これに対し、蛍光タンパク質をTagGFP2とTagRFP, CloverとmRuby2に置き換えた場合には、IP3依存的シグナル変化がほぼ消失するという結果となった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 光応答性酵素の作成に関しては、ベースとして用いるIP3合成酵素（PLCz）と分解酵素（IPP5A）の両タンパク質について構造機能相関を精査し、さらに前者については分割可能箇所を探索したことで、分子設計の方針を定めることができたため、光センサータンパク質の連結による光応答性の付与をいくつかのパターンで試みたが、光照射依存的なIP3合成速度の変化は誘発できなかった。これは光センサータンパク質のパートナーとの結合の速度や親和性、および組換えタンパク質の細胞内局在の問題が原因である可能性がある。蛍光性IP3センサーについては、C/Y-FRET型プローブの検出感度およびダイナミックレンジの改善のための手がかりを得ることができたものの、G/R-FRET型への変更に伴うIP3依存性の消失が問題となった。これはC/Y型プローブでのFRETシグナルの変化がCFPとYFPの二量体形成に依存していることが原因だと予想しており、G/R型FRETペアの蛍光タンパク質の二量体形成能の検討、もしくは二量体形成に依存しない新たなプローブの分子設計の検討が必要と考えられる。
Strategy for Future Research Activity	(1) 光応答性IP3産生酵素の作成：分割型PLCzに付加する光センサータンパク質の種類や位置について再検討する。また、分割型PLCzの一方に細胞膜局在配列を付加することで、会合したPLCzを基質近傍に局在させる等の改良を施す。 (2) 光応答性IP3分解酵素の作成：分割型INPP5Aを作成するにあたり、有効な切断箇所について検討する。さらにpMag/nMagあるいはPhyB/PIF6を用いて光応答性の付与を試みる。 (3) 蛍光性IP3センサーの改良：リンカー領域の長さを最適化するとともに、FRETペアとして二量体形成能に影響する変異を加えた蛍光タンパク質を用いてその効果を検証する。またIP3結合部位の構造変化を増幅するための方策を検討する。 (4) 光計測-光照射制御系の構築：蛍光計測に基づくIP3濃度測定から光照射によるIP3産生・分解速度調節へのフィードバック制御を可能とする光学系について、共焦点レーザー顕顕微鏡ベースのシステムに先だち、従来型蛍光顕微鏡と励起光・蛍光波長切替装置を用いたシステムを試験的に構築し、問題点を検討する。