ミスセンス変異体の安定性に注目したハイスループット機能評価系の開発

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22K19488
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 才津 浩智 浜松医科大学, 医学部, 教授 (40402838)
• Project Period (FY): 2022-06-30 – 2024-03-31
• Keywords: ハイスループットスクリーニング / 次世代シークエンス / ミスセンス変異体

Outline of Annual Research Achievements

令和4年度の解析で、当初計画していた方法では個々のクローンだけが挿入された細胞を分取するのが困難であることがわかり、変異導入後に大腸菌のシングルコロニーを単離して個々のクローンDNAを精製し、細胞にトランスフェクションを行い、蛍光強度を確認後にクローンのロングリードシークエンスを行った。

1. 変異体発現ベクターライブラリの蛍光確認: 104個のランダム変異体クローンをトランスフェクションして蛍光強度を確認したところ、GFP融合ランダム変異体の蛍光強度によって2群に分けられた（Type 1 GFP発現、Type 2 GFP減弱,）。Type 1（11クローン）およびType 2（13クローン）についてロングリードシークエンスを行った。

2. 変異体解析結果と考察: Type 2は平均変異数が4で、Type 1の平均変異数2に比べて変異が多い傾向が見られた。Type 1の3クローンは変異がヘテロ接合性にコールされているものもあり、2クローンの混合である可能性が示唆された。Type 2ではナンセンス変異やフレームシフト変異も3クローンで認められ、蛍光評価と一致する知見が得られた。患者で同定されたバリアントのデータベースであるClinVarや集団のアレル頻度のデータベースであるgnomADのデータを統合的に解析することで、各クローンでの病的ミスセンス変異が同定されたクローンが4クローンあり、合計で7クローンにおいて病的変異が同定された。興味深いことに終止コドンの変異が1クローンあり、STXBP1の終止コドンの変異も病的である可能性が示唆された。Type 1には、PolyPhen2やAlphamissense, REVELスコアいった病的予測スコアが高値の7変異が含まれており、in silicoの病的予測スコアはあくまで参考で、機能評価が重要であることが改めて確認された。