2022 Fiscal Year Research-status Report
Challenge to elucidate the mechanism of cleft palate development from gene expression analysis linked to spatial information
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22K19624
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
上岡 寛 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (80253219)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
早野 暁 岡山大学, 大学病院, 講師 (20633712)
大野 充昭 岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (60613156)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Keywords | Fillamin A / 上皮間葉転換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究目的である、口蓋発生メカニズムの解明のため、口蓋突起癒合部におけるFillamin A (Flna)の発現に注目し、主に次の4項目の研究を実施した。一つ目は、マウス胎児口蓋の培養法を用いた器官培養実験であり、口蓋突起部上皮消失の重要な因子であるTGF-βとFlnaとの関係を検討した。具体的にはTGF-β阻害薬およびTGF-βの下流で活性化するRhoA阻害薬、さらに、siRNAを用いたFlnaのノックダウンを行い、器官培養中の口蓋での反応を観察した。この結果、TGF-β阻害薬およびRhoA阻害薬を添加した口蓋では、Flnaタンパクの産生が著しく低下していた。これらのことからFlnaは既報のTGF-βやRhoAシグナルの下流で働いていることが示唆された。二つ目は、上記の器官培養法で得られた上記の結果をより詳細に調べるため、ヒト表皮角化細胞であるHaCat細胞を用いてTGF-β経路下流で発現するFlnaと上皮間葉転換についてin vitro実験を行なった。この結果の解釈に関しては追加で実験を行う必要があると考えられる。三つ目は、遺伝子改変マウスの作成である。上皮細胞特異的にFlnaをノックダウンさせるため、KRT14-CreマウスとFlna floxマウスをどちらもJackson Laboratoryから購入した。凍結胚からそれぞれの遺伝子改変マウスを作出し、現在交配を続けている。現段階で交配に問題は認められず、約3か月程度で目的のマウスが得られる予定である。また、四つ目としてNanostring社のGeoMXを用いた空間的トランスクリプトーム解析を行うための準備実験を行なった。本研究の予備実験として既にVisiumを用いたトランスクリプトーム解析を行なっているが、Flnaに特化した更なる解析を予定している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
マウス胎児口蓋の器官培養法を用いたFLNAタンパクの機能解析と遺伝子改変マウスの作成を行ったが、In vitro実験を行うことによりさらなる情報を得ることができたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は次の2項目の研究を主に進めていく。一つ目は、空間的トランスクリプトーム解析である。我々は予備実験として10x社のVisiumを用いた時空間的トランスクリプトーム解析を行なったが、今後はより解像度が高く、Flnaを産生している細胞特異的にトランスクリプトーム解析を行うため、Nanostring社のGeoMXを用いた解析を行う。これにより、Flnaを産生している口蓋突起先端被覆上皮特異的な発現遺伝子解析を行う。二つ目は遺伝子改変マウスの解析である。口蓋の癒合は胎生14日前後に生じるため、タイムドメイティングを行いKRT14-Cre; Flna flox/floxマウス胎児を解析する。具体的には、目的の遺伝子改変マウス胎児の顎顔面におけるフェノタイプを、薄切切片やコーンビームCTを用いて解析する。また、口蓋突起癒合部の免疫染色や同部から抽出したタンパクをウエスタンブロット法にて解析する。
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| Causes of Carryover |
遺伝子改変マウス購入にあたり、予定していた額よりも実際に掛かった費用が少なかった。また、予備実験として学内のトランスクリプトーム機器を使用したが、この使用料金が掛からなかったことが理由として挙げられる。しかし、翌年度に学内のトランスクリプトーム機器を使用するためのキットの購入や、得られたデータの解析を委託するため、これらの費用に充てる予定である。
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