2023 Fiscal Year Annual Research Report
細胞間隙の分子動態可視化による神経活動抑制の脳内伝播メカニズム解明
| Project/Area Number |
22K20659
|
|---|
| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
三田 真理恵 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (20964878)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-08-31 – 2024-03-31
|
| Keywords | ライブイメージング / 蛍光タンパク質 / 蛍光タンパク質センサー / バイオセンサー / プローブ / 脳 / 神経 / 脂質アンカー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、蛍光タンパク質センサーを用いたライブイメージングで、細胞間隙に存在する分子の動態解析を達成することである。本年度は、細胞外分子の可視化技術基盤の確立と、マウス脳スライス標本での解析を目指し、研究計画に従って以下の三項目を遂行した。
1)昨年に引き続き、遺伝子導入して蛍光タンパク質センサーを細胞膜外葉上に提示させる手法を検討した。それぞれのセンサーのC末端に、血小板由来増殖因子受容体の膜貫通ドメイン配列またはGPIアンカー配列を付加した。これらの遺伝子をHEK293細胞に導入したところ、GFPおよび一部のセンサーでは細胞膜上での発現が確認できた一方、細胞内で凝集体を形成するなど、細胞膜上での蛍光が確認できないセンサーがあった。蛍光タンパク質センサーの大きさが膜上で発現させる際の問題となる可能性が示唆された。
2)上記の試行と並行して、遺伝子導入を行わず、細胞外から添加して蛍光タンパク質センサーを細胞膜外葉上に提示させる手法を検討した。この手法には、脂質とポリエチレングリコールから成り、末端にNHSをもつ誘導体を用いた。この誘導体と、大腸菌を用いて合成・精製したセンサータンパク質を反応させ、N末端が修飾されたセンサータンパク質を得た。この脂質修飾センサーを細胞外から添加し、洗浄後に観察したところ、細胞外での蛍光を確認した。このことから、化学修飾により蛍光タンパク質センサーを細胞膜上に提示できることが明らかになった。
3)2)で作成した脂質修飾センサーを用い、マウス海馬スライスでの観察を試みた。海馬スライスに脂質修飾あり/なしのセンサータンパク質をそれぞれ添加した。洗浄後に顕微鏡下で観察したところ、脂質修飾した蛍光タンパク質センサーのみで細胞外での蛍光を観察した。この海馬スライス標本を用い、拡延性抑制にともなう細胞間隙の分子濃度の時間・空間変化を観察する予定である。
|
