メチル化酵素をターゲットとした肝細胞癌増殖メカニズムの解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K20949
• Research Institution: Wakayama Medical University
• Principal Investigator: 堀 雄哉 和歌山県立医科大学, 医学部, 学内助教 (50967627)
• Project Period (FY): 2022-08-31 – 2024-03-31
• Keywords: 肝細胞癌 / メチル化 / SMYD2

Outline of Annual Research Achievements

当科で保存していた肝細胞癌手術症例の凍結切片からRNAを抽出し、cDNAに逆転写しcDNA libraryを作成した。RNA抽出にはRNA protect Cell Reagent（QIAGEN）を用いて細胞を回収、RNeasy Plus Mini kit（QIAGEN）を用いて製品プロトコールに従ってRNAを単離した。続いてSuperScript III RT (invitorgen)を用いてreverse transcriptionを行った。
2．Quantitative real-time PCR
1にて作成したcDNAを用いて、quantitative real-time PCRを施行した。すでにSMYD2に特異的なquantitative real-time PCR用のprimerを設計しており、invitrogen社に依頼してオリゴを作成・購入した。Roche Applied ScienceのLightCyclerを用い、サンプルとなるcDNA・primer・2xMaster Mixを混注してPCR反応を行った。
3．免疫組織学的検討(Immunohistochemistry)
1次抗体はSanta Cruz Biotechnology社のAnti-SMYD2 (gout polyclonal antibody, C-20, sc-79084) を用いた。染色キットはDAKO EnVisonシステムを使用し、2日法で免疫染色を行った。1日目は脱パラフィン・脱キシレン・親水処理・抗原賦活化・quenching・ブロックを行い1次抗体にて4℃で一晩反応させた。2日目は洗浄後2次抗体としてDAKO® Envision System-HRPを滴下して反応させ、染色した。Hematoxylinでcounter染色を行い、脱水・固定・乾燥後観察した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定・計画通り概ね遂行している。

Strategy for Future Research Activity

当初の計画通り引き続き研究を進める。

Causes of Carryover

917,480円の残高が生じ、次年度に繰り越して実験などに使用する。