2021 Fiscal Year Annual Research Report
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21J01634
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
古林 太郎 東京大学, 工学系研究科, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 進化工学 / 分子進化 / 人工細胞 / 無細胞翻訳系 / DNA複製 / タンパク質工学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
私がフランスから日本に籍を移して当該研究を開始するにあたり、事前検討していたDNA複製反応系が日本ではうまく動作しないという問題に直面した。トラブルシューティングの結果、反応系を構成する必須因子のうちp6タンパク質(二本鎖DNA結合タンパク質)のユニークな挙動が原因であることが判明した。私が行った実験からp6タンパク質活性は極めて急峻な濃度応答性を持つことが判明し、閾値濃度以下では活性がゼロであること、および野地研究室で精製を行ったp6タンパク質の比活性がスペインのSalas研で作られたp6タンパク質の比活性よりも低いことが、DNA複製反応が動かなかった主因であることが判明した。このトラブルを受けて進化系を動かす前にまずはDNA複製反応の挙動をより定量的に特徴付けることが必要と判断し、単純人工ゲノムの複製能をアウトプットとして、p6以外の必須因子も含めて、反応系を構成する重要因子の量を振ってDNA複製系が安定して動作する条件をより詳細に明らかにした。
上記の基礎検討と並行して、私はDNA複製系の反応場となる無細胞翻訳系の活性を向上させる新しいプロトコルを発明した。本研究のようなin vitro進化系においてはDNAを1分子だけ区画に封入して発現させる必要があるが、生細胞に対して再構成型無細胞翻訳系のタンパク質合成能力は10～100倍程度低く、マイクロメートルサイズの区画内でDNA1分子という低濃度(100fM～100pMのオーダー)から指向性進化に十分なタンパク質を合成することは困難な課題であった。私は無細胞翻訳系の内容物を変更することでバルクおよび微小リアクタアレイ内の両方で無細胞翻訳系のタンパク質合成能力を3～8倍程度向上させることに成功した(※タンパク質の種類により向上の度合いが変動する)。本成果は2022年度前半に論文として投稿できる目処が立っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DNA複製系に限れば上記予想外のトラブルにより当初計画よりもやや遅れているが、DNA複製の反応場となる無細胞翻訳系の改良において予想外の進展が見られ論文化も視野に入っているため、トータルでみて順調に進展していると評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
前述のDNA複製系の定量的特徴解析を完遂したのち、基本的には計画書通りに進行させる予定である。1年目と2年目の進化実験は原理的には並列的に実行でき、時間の短縮は可能である。
計画と異なり得る点として、マイクロリアクタデバイスを用いたスクリーニングが困難である場合の微小区画系のバックアップとしてホモジェナイザーを用いたエマルション系の検討を始めている。こちらを用いてDNA複製反応の区画化と進化実験を行う可能性がある。
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