2022 Fiscal Year Annual Research Report

オーキシン流入担体AUX/LAXの機能構造解析によるオーキシン輸送機構の解明

Research Project

Project/Area Number	21J20518
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	萩野達也東京大学, 理学系研究科, 特別研究員(DC1)
Project Period (FY)	2021-04-28 – 2024-03-31
Keywords	構造生物学 / 植物 / オーキシン / 膜輸送体
Outline of Annual Research Achievements	AUX/LAXシンポーターは植物において生育に重要な植物ホルモンであるオーキシンの細胞内への流入に携わる膜輸送体である。オーキシンは生体内で生合成され、極性輸送によって特定の器官ごとに成長促進や屈性などの生理作用を引き起こすだけでなく、化学合成されたものが農薬として利用されている。本研究ではAUX/LAXシンポーターのアポ状態及び輸送基質である天然のオーキシンや農薬との複合体における立体構造を決定することで、植物のオーキシン輸送における輸送体の構造変化や基質認識機構といった詳細な分子基盤の解明を目的としている。これまでの実験において高純度での精製に成功したシロイヌナズナ由来AUX1およびダイズ由来LAX9について、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析による構造決定を目指して、試料調製条件やグリッド作製条件についての検討を行った。その結果、ダイズ由来LAX9について十分な粒子像の観測できるクライオ電子顕微鏡像の取得に成功した。この撮影データを用いて単粒子解析を試みたところ、十分な量の粒子像が得られていたものの粒子の二次元平均化像の収束が確認できず、三次元密度マップへの再構成が不可能であった。解析におけるパラメータの検討を行ったが、最終的にダイズ由来LAX9の三次元密度マップを得ることはできなかった。比較的分子量の小さな膜タンパク質の構造解析において、膜タンパク質を人工的な脂質二重層に再構成するという脂質ナノディスク法を用いた研究例が近年多く報告されており、現在はシロイヌナズナ由来AUX1およびダイズ由来LAX9について脂質ナノディスクへの再構成に関する検討を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 前年度にて高純度での精製に成功したシロイヌナズナ由来AUX1およびダイズ由来LAX9について、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析による構造決定を目指して、試料調製条件やグリッド作製条件についての検討を行った。その結果、ダイズ由来LAX9について十分な粒子像の観測できるクライオ電子顕微鏡像の取得に成功した。この撮影データを用いて単粒子解析を試みたところ、十分な量の粒子像が得られていたものの粒子の二次元平均化像の収束が確認できず、三次元密度マップへの再構成が不可能であった。解析におけるパラメータの検討を行ったが、最終的にダイズ由来LAX9の三次元密度マップを得ることはできなかった。単粒子解析に失敗した原因として考えられる要素として、AUX/LAX シンポーターの立体構造に起因する困難性が挙げられる。AUX/LAX シンポーターのアミノ酸配列から予測される立体構造において、細胞膜の外側に特徴的なドメインがほとんど存在しない。膜タンパク質の単粒子解析では一般的にミセルに覆われていない膜外ドメインの特徴を基準として粒子の画像のアラインメントが行われることから、ミセル条件での AUX/LAX シンポーターは単粒子解析に不向きであることがうかがえる。
Strategy for Future Research Activity	膜外ドメインの特徴量に乏しいAUX/LAXシンポーターの立体構造を単粒子解析によって決定するにあたり、以下に示すような実験を計画している。はじめに、膜タンパク質を人工的な脂質二重層へ再構成する脂質ナノディスク法という手法を AUX/LAX シンポーターの立体構造解析に応用する。この手法において再構成されるナノディスクは界面活性剤のミセルに比べて大きさが小さい。その結果膜貫通部位のシグナルが相対的に強くなるため、特に膜外ドメインに乏しい膜タンパク質の構造解析において有利に働く。実際に近年この手法を用いることで膜外ドメインに乏しい膜タンパク質の構造解析に成功している例は多いため、本研究においても AUX/LAX シンポーターのナノディスク再構成を行ったうえでの立体構造解析を試みる。この手法でも立体構造の決定に至らなかった場合には、膜外ドメインの代わりとなるようなタグの挿入または膜外領域に結合する構造認識抗体の作製を行うことにより、膜外領域における特徴量を増やす。タグの挿入を行う場合は自然な立体構造とは異なる場合があるため、少なくともトランスポーターとしての輸送活性についての議論を行えるかの確認のため、リポソームを用いた基質輸送アッセイによって輸送活性をあらかじめ確認したのち構造解析を試みる。またアポ状態と並行して、輸送基質となるインドール-3-酢酸 (IAA) や 1-ナフタレン酢酸 (1-NAA)との複合体についても同様に構造解析を行う。決定した両構造の比較から、基質認識や輸送に重要な箇所を同定する。