ゲノム編集細胞の光学スクリーニングによる機能獲得型変異体ライブラリの迅速創出

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21J20659
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: Hu Xixun 東京大学, 工学系研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2021-04-28 – 2024-03-31
• Keywords: CRISPR imaging / CML / Ph chromosome / TKI resistance

Outline of Annual Research Achievements

プロジェクト概要
ゲノム変異はがんなどの疾患の原因の一つであるが、生きた細胞で特定のDNAを検出する技術がないため、研究が制限されている。そこで、CRISPRイメージングを用いて、生きた慢性骨髄性白血病細胞におけるPh染色体を可視化・定量化するプラットフォームを開発し、TKI治療に反応しない2xPh細胞の抵抗性を評価することで、CML患者の治療法開発に貢献することが期待される。
この研究を完全に実行するために、私は研究計画を3つのステップに分けました。ステップ1：効果的なゲノム標識のためのRNPベースのCRISPRイメージングを開発する。ステップ2：CML細胞株におけるPh染色体の存在を確認する。ステップ3：2xPh細胞に対する薬剤スクリーニングを実施する。
現在の状態
ステップ1について：1年目は、RNPベースのCRISPRイメージングを開発しました。これは、dCas9融合体のタンパク質設計の最適化とCRISPRシグナルの最適な観察条件の決定を行った。これらの改善により、U2OS細胞においてChr13と19の検出率（CRISPRシグナルを含む細胞の割合）が約40%から90%へと大幅に向上しました。これらの結果から、本システムはPh染色体のマーカー遺伝子であるBCRとABLの標識にも有効である可能性が示唆されました。2年目には、dCas9-GFPとdCas9-RFPを同時に用いたマルチカラーラベリングシステムを開発しました。この進化により、BCRとABLの共局在を観察し、Ph染色体を特定することが可能になりました。これらの成果により、ステップ1は終了しました。ステップ2について：2年目には、U2OS細胞でCRISPRシグナルが頻繁に検出される、BCRとABL遺伝子を標識する特定の領域を特定しました。現在、このステップに取り組んでいます。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

1）RNPベースのCRISPRイメージング技術の最適化が予想に達しなかった：修飾されたsgRNA、より多くの蛍光タンパク質融合など、より高い感度のCRISPRイメージング技術を追求するために、多くの試みを行いましたが、予想に達する効果は得られませんでした。
2）CML細胞のための実験条件の最適化：異なるCML細胞株には異なる電気変換条件が必要であるため、CRISPRイメージングに基づくゲノム検出技術をCML細胞で高効率に再現するために、長期にわたり条件を最適化する必要がありました。
3）新型コロナウイルス感染症の影響により試薬や材料の調達が遅れた：電気変換試薬キット、CML細胞株、FISHプローブなどの材料を注文する際に、予期しない遅れが発生し、実験の進捗に支障をきたしました。

Strategy for Future Research Activity

今後の予定
ステップ2について：次のステップでは、RNPベースのCRISPRイメージングとFISHの両方を用いて、CML細胞株であるK562のBCR遺伝子とABL遺伝子の標識を確認することになります。続いて、Ph染色体を定量化する方法を開発し、CML細胞株におけるPh染色体の頻度を明らかにする予定です。
ステップ3について：K562でPh染色体が1細胞レベルで定量されたら、異なるTKI処理後の2xPh細胞の細胞アポトーシスをリアルタイムで観察する予定です。